抗体工程的新纪元：SELEX技术
发布日期：2012-04-27 10:49 文章来源：<a href="http://www.dxy.cn">丁香园</a>
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抗体工程
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回顾20世纪，分子生物学及其相关学科的发展给科学研究和人类生活带来了日新月异的变化，同时也更新了一些传统概念。比如，自20世纪30年代以来，人们一直认为"所有的酶都是蛋白质"。1986年，Lerner等首次研制成功催化水解羧酸酯的抗体，称之为抗体酶（Abzyme）。1987年，Cech等发现了具有催化活性的RNA分子，称之为核酶（Ribizyme）。新近又发现了特异切割RNA的DNA分子，称之为脱氧核酶（DNAzyme）。现在，可以给酶下这样的定义：“酶是生物体内一类具有催化活性和特殊空间构象的生物大分子物质，包括蛋白质和核酸等”。
抗体是机体免疫系统中最重要的效应分子，具有结合抗原、结合补体、中和毒素、介导细胞毒、促进吞噬和通过胎盘等功能，发挥抗感染、抗肿瘤、免疫调节与监视等作用。抗体的研究始于18世纪末，即1890年德国学者Von Behring证明免疫动物血清中存在抗毒素（抗体）。随后又相继发现了凝集素、沉淀素、溶血素、溶菌素和补体结合素等。
随着DNA结合蛋白研究的深入，受组合化学、抗体库和随机噬菌体肽库技术的启发，Gold等于1990年构建了随机核酸库并从中筛选出与靶蛋白特异结合的核酸配基，命名为指数富集的配基系统进化技术，简称SELEX技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）。目前已从核酸库中筛选出多种与蛋白质、核酸、小肽、氨基酸、有机物、金属离子等特异结合的配基并应用于临床治疗和诊断。为此，我们提出这样的设想：核酸（脱氧核酸）能否作为抗体分子而替带免疫球蛋白？能否在体外合成抗体分子而改变抗体生产的传统途径，开创抗体工程的新纪元？
一、抗体的产生途径
抗体的产生途径有三条：一是经典途径，即通过免疫动物产生多克隆抗体；二是细胞工程途径即用杂交瘤技术生产单克隆抗体；三是利用基因工程途径表达和改造抗体。
但是，蛋白类抗体的生产与应用存在如下限制：
毒性抗原免疫动物承受不了，免疫原性弱的难以产生抗体；杂交瘤产生于鼠，治疗应用受限（HAMA）；异源抗体在诊断中产生非特异性反应（假阳性），还受到类风湿因子和自身抗体的干扰；成本高、费时费事，罕见抗体需大量筛选才能得到；克隆株（细胞）的有效保存不易，有些杂交瘤难以在体内生长；批间质量不一，诊断时要重新优化；体内与体外的识别特异性有差别；抗体-靶相互作用的动力学参数无法依要求改变；寿命有限；对温度敏感，发生不可逆变性。
二、SELEX技术及其优越性
核酸类抗体（配基）的筛选过程称之为SELEX技术，其基本原理就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其中随机序列长度在20～40bp左右，文库容量在1014～1015之间。由于单链随机寡核苷酸片段特别是RNA易形成发卡、口袋、假节、G-四聚体等二级结构，能与蛋白质、核酸、小肽、氨基酸、有机物，甚至金属离子结合，形成具有很强结合力的复合物。利用这一原理，将随机寡核苷酸文库与抗原或药物等靶分子相互作用，洗脱筛选出特异寡核苷酸配基（aptemer），经RT-PCR及体外转录生成新的次一级文库，再与该靶子结合。反复数个循环，即可筛选出能与该靶子特异结合的寡核苷酸片段（图1）。
随机寡核苷酸文库，特别是随机RNA文库，与现在常用的蛋白、多肽以及合成的小分子有机化合物库相比，具有如下优点：
1、作用的靶分子范围更广
对靶无限制，包括金属离子、有机染料、药物、氨基酸、复因子、糖、抗生素、核酸、碱基类似物、核苷酸、多肽、酶、生长因子、抗体、基因调节因子、细胞粘附因子、植物血凝素、完整的病毒颗粒和致病菌等；
2、筛选出的配基与靶分子的结合能力更强
甚至强于天然配基，解离常数（kd）多在pMol/L～nMol/L之间；
3、与靶分子结合的特异性更强
能够分辨出靶分子结构上细微的差别，可以区分1个甲基或1个羟基的差别。如茶碱与其他黄嘌呤类似物咖啡因、可可碱的结构非常相似，常规的茶碱单抗检测与后二者有交叉反应，而通过SELEX技术筛选到的寡核苷酸配基只特异结合茶碱，与其他两种物质无反应，其中与茶碱的亲和力比与咖啡因的亲和力高10，000倍。通过反向SELEX筛选，可以有效减弱以至消除既与靶分子结合，又与靶分子类似物结合的寡核苷酸配基，从而筛选出特异结合靶分子的寡核苷酸配基。从混合体系中筛选某一已知或未知靶分子的寡核苷酸配基，反向SELEX技术显示出其独特的价值，比如，用于寻找特异结合某种肿瘤标志物的寡核苷酸配基，就可以用健康个体的组织细胞进行预筛选，除去与背景结合的序列，从而筛选出目的寡核苷酸配基。
4、异质性程度更高
随机寡核苷酸文库中每一条随机寡核苷酸，其随机区的每个核苷酸位置都存在四种可能性，如果随机区有n个核苷酸，那么随机序列的多样性有n4种，再加上稀有碱基或人为修饰碱基，随机序列的多样性会更多。一般随机区域的长度为30个核苷酸左右，文库的容量能达到1014～15。比同等长度的肽热温度结构多，10个nt即可形成发卡、环攀等结构单元，尤其是可以引入iso G/iso C等分子进一步增加多样性。而随机肽库因为受编码肽的基因偏性、大肠杆菌转化效率和生物系统选择的限制，其多样性有限。
5、筛选周期更短
一般只需要8～15个循环，约2～3个月时间，并且目前其筛选过程已经可以自动化。而制备单克隆抗体，如果顺利的话，至少也需要3～6个月时间。
编辑: wangminchao