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 干细胞概述
林 戈，卢光琇
（中南大学生殖与干细胞工程研究所，人类干细胞国家工程研究中心，长沙 410078）

 摘　要：干细胞是存在于胚胎和成体中的一类特殊细胞，它能长期地自我更新，在特定的条件下具有分化形成多种终末细胞的能力，不同来源的干细胞分化潜能各异。从早期胚胎内细胞团分离的胚胎干细胞能分化形成个体所有的细胞类型，并具有在体外无限增殖的能力，是最具有临床应用前景和研究价值的干细胞之一。在成体各种组织和器官中也存在成体干细胞，用于维持机体结构和功能的稳态。近期有关成体干细胞可塑性的研究和成体组织中多能干细胞存在的证据扩大了人们对成体干细胞分化潜能的认识。干细胞具有的多向分化潜能和自我更新能力使其成为未来再生医学的重要种子细胞，并成为研究人类早期胚层特化和器官形成、药物筛选以及基因治疗的最佳工具。

关键词：干细胞；分化；多能性；胚胎干细胞；成体干细胞；可塑性

　　20 世纪是生命科学和医学飞速发展的一百年。DNA双螺旋结构的发现、聚合酶链反应等分子生物学技术的日新月异以及人类基因组测序工作完成等一大批成果，使人类开始从分子水平上重新认识生命现象的本质；抗生素、疾病疫苗的诞生使人类能够摆脱数千年来严重威胁人类生命健康的重大传染性疾病，在众多新医疗技术的保护下，人类的平均寿命逐年延长，人类认识和保护自身的能力有了长足的进步。进入21 世纪，新的问题接踵而至。人口老龄化、环境污染以及饮食结构不合理等因素，导致了心脑血管疾病、癌症、糖尿病和帕金森氏症等多种退行性疾病的发病率逐年上升。由于缺乏有效的治疗手段，这些疾病已成为人类生命的主要威胁，由此引发的一系列问题给社会带来沉重的负担。在生命科学研究领域，探索的征途也永无止境，譬如：有关人类发育的奥秘仍然是无人企及的原始地带；人类基因组计划完成后，如何来解读这本人类“生命的天书”仍需要大量的工作，等等。干细胞的出现为解决以上问题带来了新的机遇。在21 世纪之初，干细胞研究就曾连续两年被美国Science杂志评为十大科学进展之一，并被推举为21世纪最重要的十项研究领域之首，位居 “人类基因组测序”这一浩大工程之前。目前，干细胞相关技术的研究已经成为各国科技竞争的焦点，而在我国刚刚颁布的国家“十一五”规划纲要中，也明确提出重点支持干细胞研究。

　　干细胞究竟有何魅力，使得科学界和各国政府给予其如此大的关注和投入？干细胞是否会启迪我们进一步认识生命的奥秘？干细胞研究在不远的将来可能会给疾病的治疗带来什么帮助？本文将简要介绍有关干细胞的一般性概念，并就干细胞的应用前景做一简单概述。

    1　涉及干细胞的一些基本概念

    1.1　什么是干细胞　

　　干细胞是指那些具有长期自我更新和产生至少一种终末分化细胞能力的细胞。细胞是生命活动的基本单位。人是多细胞生物，在人体内总共有200 多种细胞，他们通过有机整合形成复杂的组织和器官，并进一步形成人体这一结构精密的有机体。这200 多种细胞是完全分化的成熟细胞，它们各有其特殊的结构并执行特定功能，例如收缩的心肌细胞，或者传递信息的神经细胞等。虽然其中的部分细胞还具有有限的增殖能力，但都已经是终末分化细胞，就像一棵参天大树最末端的树叶，在生命周期中完成其使命后就将死亡。

　　干细胞是一类特殊的细胞，“干”译自英文“stem”，意为“( 树) 干”和“起源”。干细胞就如同树的枝干，是一群结构和功能未特化的原始细胞。干细胞一个很重要的特点是自我更新，指的是干细胞在长期的细胞增殖过程中，每次细胞分裂后产生的子代细胞中至少有一个(或同时两个)还保持着干细胞的原始状态，即干细胞能够长期的进行自我复制。干细胞另一个重要的特点是分化能力，尽管干细胞停留在原始状态，但是在特定条件下能够分化产生一种或多种终末细胞。分化后的终末细胞具有特殊的结构，能够执行特定的功能，例如，胰腺β 细胞能够合成并分泌胰岛素以维持血糖的稳定。在体内还存在有另一种未完全特化的原始细胞，称为祖细胞 (progenitorcell)，也具有向终末细胞分化的能力，但却不能自我更新，部分可以短期的自我复制，但经过几次细胞分裂后，产生的子代细胞最终都会分化。祖细胞是干细胞向终末细胞分化的中间阶段细胞。

1.2　干细胞的分化潜能　

　　干细胞根据来源不同，可分为胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)和成体干细胞(adult stem cell, ASC)。来源不同的干细胞分化潜能也不同。分化潜能越大，分化得到的细胞类型越多。生命开始于受精卵，这个单细胞可以发育成一个完整的个体(包括胚胎和支持胚胎发育的胎盘等胚外组织)，这种潜能称为全能性(totipotency)。此后，一直发育到8 细胞胚时期，每一个卵裂球理论上都是全能的。就人类而言，全能性细胞只存在于胚胎发育的前三天。目前尚没有体外成功培养扩增全能性干细胞的报道。

　　当胚胎发育至16 细胞胚时期，启动了第一次的分化，一直到出现囊胚阶段，第一次分化结束，此时出现了两种不同的细胞类型：外胚滋养层细胞——包绕在外形成囊腔壁，将来发育形成胎盘；内细胞团——在囊腔内明显位于一极，将来发育形成胚胎。单独移植内细胞团到子宫不能形成新的个体，因为它不能分化出胎盘支持胎儿生长，因此它不再具有全能性；但在囊胚内的内细胞团是将来发育成胎儿的部分，仍具有分化形成三个胚层不同细胞类型的潜能，我们称为多能性(pluripotency)。多能性细胞在正常胚胎的发育过程中，只出现一至两天的时间，随后则不断渐进分化，最终形成成熟个体中的200 多种细胞类型。分离囊胚的内细胞团在体外合适的条件下培养，可以阻止正常的分化过程，使其仍保持多能性的状态并可以无限的增殖，这种多能性干细胞就称为胚胎干细胞。需要说明的是，尽管在人工培养条件下获得的胚胎干细胞仍然保持着内细胞团的多向分化能力，但是由于其必须适应体外培养环境并且不断的增殖，有研究显示胚胎干细胞的基因表达谱与内细胞团已出现明显的差别。因此，可以说胚胎干细胞是人工环境下培养出的“人造物”。内细胞团并不是多能性干细胞的惟一来源。

　　早在1964 年，人们就发现从性腺组织来源的恶性畸胎瘤中能分离得到一种多能性干细胞[2]。恶性畸胎瘤是由生殖细胞癌变产生的恶性肿瘤，由来源于三个胚层的多种细胞和组织无序排列构成，其中含有一些尚未特化的细胞。这些细胞被分离后可在体外无限培养扩增，并一直保持向三胚层的多种细胞分化的能力，被称为胚胎癌细胞(embryonal carcinorma cells)。在20 世纪70 年代，小鼠胚胎癌细胞曾被广泛的用来研究小鼠早期的发育。由于其仍然具有肿瘤细胞的特点，核型不正常且多向分化潜能有限，在1981年小鼠胚胎干细胞分离培养后，其研究价值逐渐被取代。由于恶性畸胎瘤是生殖细胞起源，此后有人尝试从胎儿期的原始生殖细胞分离多能性干细胞。原始生殖细胞是在三胚层分化前，从囊胚多能性细胞群中迁移出来而停留在卵黄囊内壁的一群细胞，因此其得以逃脱胚层特化时的信号。在随后的个体发育中，原始生殖细胞又会沿着原始消化道系膜迁移回胚胎，最终定位于生殖嵴内形成配子。分离原始生殖细胞体外培养可以获得另一种多能性干细胞，称为胚胎生殖细胞(embryonic germ cell, EGC)。

　　人的胚胎生殖细胞系和胚胎干细胞系都是于1998 年建立的，在两年后对它们进行比较发现，人胚胎干细胞的数量在两年内扩增了300~400 倍，而胚胎生殖细胞只有70 倍。同时在验证细胞多能性的体内分化实验中，胚胎生殖细胞并不能像胚胎干细胞一样能在免疫缺陷小鼠体内形成畸胎瘤[5]。这说明胚胎生殖细胞的体外增殖能力和分化潜能均比胚胎干细胞要弱。就这三种多能性干细胞而言，胚胎干细胞由于具有正常的核型，在体外增殖迅速，并且三胚层分化能力确定而成为最有研究和应用价值的材料。

　　1998 年，人类胚胎干细胞的分离成功，引发了世界范围内干细胞研究的热潮。但有关干细胞的研究其实始于20 世纪60 年代，人们发现在脾中存在能分化形成多系造血细胞的原始细胞。此后，研究发现在成体内一些经常更新的组织，如血液、皮肤和肠道粘膜上皮中存在着干细胞，它们能不断地提供分化细胞用以补充组织中衰老死亡或受损的细胞。以血液系统为例：一个体重70 公斤的人，每天需要更新至少100 亿个血细胞，这种消耗量就依赖造血干细胞分化产生的前体细胞先扩增再分化来补充。

　　近年来，有关成体中存在干细胞的认识不断更新。首先，人们发现一些曾认为成熟后不再进行分裂的组织，如脑、肝中也存在着干细胞。随着研究的深入，发现有干细胞存在的组织类型也越来越多，包括肝、胰、角膜、视网膜、血管、骨骼肌、牙髓、皮肤和脂肪等。目前的观点是在成体的不同组织中广泛存在着成体干细胞，它们主要用于维持组织器官结构和功能的稳态，只是随着年龄的增长，干细胞的数量逐渐减少。成体干细胞也具有向多种细胞类型分化的能力，如造血干细胞可以分化形成红系、粒系、髓系等多种血细胞；而骨髓来源的另一种成体干细胞，间充质干细胞能分化形成骨、软骨、肌肉、脂肪等多种中胚层细胞。成体干细胞的这种多向分化能力被称为多向潜能性(multipotency)，但与胚胎干细胞的多能性是有区别的，其多向分化能力往往局限在同一胚层或同一系统内的多种细胞类型，因此，也有人将其翻译为单胚层多能性，而将胚胎干细胞称为三胚层多能性以示区别]。

　　从20 世纪90 年代末期以来，大量的研究发现成体干细胞的分化能力可以不局限在其来源的胚层内。1997 年，研究者发现移植的骨髓干细胞可以在小鼠体内分化为神经胶质细胞[7]，随后越来越多的研究发现源自小鼠外周血或骨髓的干细胞(中胚层起源)可以分化为神经细胞、神经胶质细胞、皮肤(外胚层起源)和肝细胞(内胚层起源)等；而神经干细胞则可以分化形成血细胞、骨骼肌细胞等。以上结果表明，成体干细胞的分化潜能可能远比我们预想的要大，不同来源的成体干细胞可以跨胚层分化为其他的细胞类型，这被称为横向分化( transdifferentiation)。成体干细胞的这种横向分化能力又称为可塑性(plasticity)。在胚胎干细胞倍受伦理争议的情况下，有关成体干细胞可塑性的研究结果吸引了广泛的关注，被认为是能有效推动干细胞临床应用的关键发现。就如同“多莉”羊的诞生，改变了人们关于成体细胞发育已经定型不可逆转的概念。

　　进入21 世纪，有关成体干细胞可塑性的研究波澜再起。首先，2002 年来自于美国的两个研究小组先后在Science杂志发表“骨髓细胞不能在体内横向分化为神经细胞”[8]以及“成年造血干细胞可塑性证据不足”[9]的研究结果，表明成体干细胞的可塑性很可能是实验设计不严谨所造成；其次，陆续有研究发现，在成人的多种组织中，例如骨髓、肌肉和脂肪组织中存在胚胎干细胞样的原始细胞，被称为多向潜能性成体祖细胞(multipotential adult progenitorcell, MAPC)，单个的MAPC 无论在体外或体内(被注射到囊胚内)能形成三个胚层几乎所有的细胞类型。成体干细胞中MAPC的混杂造成了可塑性的假象；再次，2002 年，在Nature 杂志上，来自英国和美国的两个研究组分别报道了成体干细胞在体外与胚胎干细胞融合后，能获得胚胎干细胞的特性[10~11]。因此，成体干细胞可塑性的发生也有可能是由于移植的成体干细胞与体内存在的原始细胞自发融合的结果，而导致成体干细胞具备了向其他胚层分化的能力。以上有关成体干细胞可塑性的争论仍在继续着，但无疑，近几年来有关干细胞的研究已经进入一个爆炸式增长阶段，人们对于干细胞的认识将不断地更新。

2　干细胞的应用前景

2.1　临床应用：

　　细胞、组织和器官的替代治疗　组织器官的损伤以及功能障碍是危害人类健康的主要因素之一，很多人类疾病与特定器官、组织、细胞的病变或受损有关，如心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤、帕金森氏症、严重烧伤、脊髓损伤、肝硬化等。替代治疗(replacement therapy)是治疗这类疾病的理想方法，即移植功能正常的细胞、组织和器官来替代受损的部位。目前临床上进行的替代治疗多来自于供体捐献，例如从流产胎儿脑组织分离多巴胺能神经元移植治疗帕金森氏症患者，或从健康供者胰腺分离胰岛组织移植治疗I型糖尿病患者以及肝、肾等供体器官移植。然而，供体来源匮乏是当前替代治疗面临的最大困境。我国目前人体器官的供求比为1∶100，每年全国约有3 000 名患者接受肝移植，而需要肝移植的患者却多达30 多万；全国有大约150 万尿毒症患者，每年却仅能做3 000例左右肾脏移植手术。寻找新的移植物来源成为当务之急。干细胞，由于其具有多向分化潜能，被认为是替代治疗最佳的"种子细胞"。干细胞分化的多种细胞类型可用于细胞替代治疗，将其与组织工程技术结合，甚至能在实验室中培育出可用于移植的各种组织和器官。

　　成体干细胞和胚胎干细胞是目前干细胞研究的两个主要领域，而有关两者谁更适合成为未来替代治疗的"种子细胞"一直存在着争论。人胚胎干细胞之所以倍受瞩目，在于它具有成体干细胞无可比拟的优势：可在体外无限增殖并能分化为体内任何一种细胞类型。形象地说，胚胎干细胞将可能成为一个取之不尽、用之不竭的人类零部件加工厂，但胚胎干细胞真正应用于临床还有很多问题亟待解决。首先，胚胎干细胞不能直接用于移植，其自然的分化具有多向性，如果将胚胎干细胞直接移植至免疫缺陷小鼠体内，将形成由三个胚层的多种细胞无序混杂形成的结构即畸胎瘤。当前面临的挑战是如何诱导胚胎干细胞定向分化为特异的细胞类型，以及移植后如何促进移植物与机体其他细胞的功能整合。其次，胚胎干细胞分化产物的移植仍然属于同种异体移植，如何避免移植后的免疫排斥？可能的方法包括："治疗性克隆"，即将患者体细胞核移植入去核卵母细胞中构建重构胚，再从中分离胚胎干细胞， 获得的胚胎干细胞具有与受体细胞完全一致的基因型，从而避免了免疫排斥；通过基因工程技术敲除引起免疫反应的关键基因(如MHC基因); 或将同一胚胎干细胞系诱导分化所获得的造血干细胞与待移植细胞一起移植，诱导患者免疫耐受，都是可能避免排斥发生的途径。再次，由于胚胎干细胞的分离需要破坏早期的人类胚胎，在西方教会国家存在是否亵渎人类生命的伦理学争论，也妨碍了胚胎干细胞的研究和应用。

　　成体干细胞移植用于临床实践最早始于第二次世界大战结束后，日本学者尝试用骨髓移植来治疗辐射病患者严重的骨髓抑制。如今，造血干细胞移植已经成为了干细胞替代治疗的先锋，而其他的成体干细胞大部分仍然处于研究阶段，少见临床应用的报道。由于成体干细胞可以取自患者自身的各种组织，其临床应用不存在免疫排斥的问题和伦理道德上的压力。这是它相对于胚胎干细胞明显优越之处。然而，成体干细胞也有限制其临床应用的瓶颈。首先，组织中干细胞的数量很少，缺乏细胞表面标志难以将其分离纯化。就骨髓细胞来讲，每1 万~1.5 万个细胞中仅有1 个造血干细胞，而目前，也不能确定是否所有的组织中均存在可供分离的干细胞。其次，能否实现成体干细胞的体外扩增仍有争论。尽管成体干细胞具有长期自我更新的能力，但大多以不对称分裂的方式进行，每次分裂后有一个细胞仍然为干细胞，而另一个则分化为祖细胞。因此，有学者认为体外扩增的往往是祖细胞，干细胞的数量变化并不大，并且大部分成体干细胞的增殖能力也是有限的，能否提供临床充足的细胞来源尚难确定。最近有研究报道从骨髓、肌肉等成体组织中发现了MAPC，似乎可以在体外不受限制的生长，并且具有类似胚胎干细胞的多能性。果真如此的话，成体来源的MAPC将有可能取代胚胎干细胞成为最合适的"种子细胞"，并推动干细胞的临床应用。此外，成体中的干细胞数量会随着年龄的增长而逐渐减少，需要回答的问题是能否从老年患者体内获得多能性成体干细胞用于移植。

2.2　基础研究应用干细胞是研究人类发育的最佳模型。

　　由于对人类在子宫内的各个发育阶段的观察和实验难以进行，有关人类早期发育的研究一直难以开展。以往只能通过对果蝇、斑马鱼和小鼠等模式生物的研究来获取人类发育的相关信息，而物种间的差异使研究结果尚不足以完全反映人类发育的情况。干细胞具有多向分化潜能，以干细胞作为模型，可在体外再现从内细胞团分化至各个组织器官发育的过程，为研究人类早期发育的机制提供了平台。例如可以通过研究干细胞不同分化阶段的基因表达情况，了解有哪些基因参与了特定的发育过程；也可以在分化的过程中控制某关键基因在特定时期表达或沉默，从而研究该基因在不同发育时期中的作用。这将有助于阐明某些早期胚胎发育缺陷的相关机制，帮助我们找到预防与治疗的方法；有助于我们利用发现的关键基因和因子定向诱导干细胞向特定的功能细胞分化等。

　　干细胞也是进行基因操作很好的工具。近十年来，有关将外源基因导入细胞的技术有很大的发展，但是外源基因能成功整合入细胞基因组并长期稳定表达的效率并不高，而干细胞具有很强的自我扩增能力，能够耐受基因导入后长时间的筛选过程，一旦与外源基因整合，单个稳定表达的细胞就能无限扩增成为稳定的转基因细胞系用于研究，从而避免了体细胞增殖能力有限，需要反复导入的问题。因此，可以利用干细胞作为基因治疗的载体进行移植。由于对基因的改造和修饰可以在体外培养的细胞中完成，减少了基因直接用于人体治疗的未知不良影响。

　　干细胞还可以作为很好的药物筛选平台。目前药物的筛选大多采用整体动物模型或细胞株作为进行药理、毒理的检测系统。动物模型具有物种间的差异，不能完全代表人体反应，而大多数人细胞株多为永生化的肿瘤细胞系，难以反映正常人类细胞的反应性。以干细胞体外分化作为正常人类发育的模型，可用于检测药物对发育的影响，或通过干细胞分化获取多种类型的正常体细胞，可用于检测药物对不同细胞的毒理作用。干细胞及其相关技术的发展有可能为现有的药物筛选体系带来革命性的进步。

　　干细胞及其相关技术的发展为生命科学研究注入了新的生机，用干细胞造福人类是科学家们的梦想。目前干细胞距离真正临床应用还有一段漫长的征途，许多悬而未决的难题有待解决，如胚胎干细胞维持不分化的分子机制及其定向诱导分化的机制尚不明确；如何分离、鉴定成体干细胞仍是其应用于临床的巨大障碍；干细胞在体外长期培养的安全性也是亟待解决的问题，等等。尽管如此，我们还是有理由相信，干细胞将是21世纪最伟大最有前景的研究领域之一，对干细胞的掌握、调控及应用终会实现。