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4、杂交瘤细胞的克隆化

从原始孔中得到的阳性杂交瘤细胞，可能来源于二个或多个杂交瘤细胞，因此它们所分泌的抗体是不同质的。为了得到完全同质的单克隆抗体，必须对杂交瘤细胞进行克隆化。另一方面，杂交瘤细胞培养的初期是不稳定的，有的细胞丢失部分染色体，可能丧失产生抗体的能力。为了除去这部分已不再分泌抗体的细胞，得到分泌抗体稳定的单克隆杂交瘤细胞系（又称亚克隆），也需要克隆化。另外，长期液氮冻存的杂交瘤细胞，复苏后其分泌抗体的功能仍有可能丢失，因此也应作克隆化，以检测抗体分泌情况。通常在得到针对预定抗原的杂交瘤以后需连续进行2-3次克隆化，有时还需进行多次。所谓克隆化是指使单个细胞无性繁殖而获得该细胞团体的整个培养过程。克隆化的方法很多，如有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪（FACS）分离法。这里介绍最简单也是使用最广泛的前两种方法。

（1） 有限稀释法

材料：

a.  96孔细胞培养板等；

b.  HT培养基；

c.  活力强的杂交瘤细胞；

d.  小鼠腹腔细胞。

方法：

a.  制备小鼠腹腔细胞。同“细胞融合”一节中的方法。

b.  制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20%血清的HT培养基稀释至每毫升含2.5、15和50个细胞3中不同的稀释度。

c.  按每毫升加入5×10⁴-1×10⁵细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞。

d.  每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为0.2ml，每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10。

e.  37℃、7.5% CO2湿润培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。

f.  取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。

g.  本法中（b）、（c）、（d）也可简化为将计数后的杂交瘤细胞准确地进行系列稀释，直至每毫升含10个细胞，按每孔接种0.1ml细胞悬液，即每孔含1个细胞。

（2） 软琼脂法

材料：

a.  HT培养基（双倍浓度）。

b.  用0.15mol/L NaCl配制的2.0%琼脂糖：称取2.0g细胞培养用琼脂糖，悬浮于100ml 0.15mol/L NaCl，121℃高压灭菌15分钟，分装10ml小瓶，冷却后4℃保存。

c.  小鼠腹腔细胞。

d.  灭菌平皿。

e.  45℃水浴。

f.  活力很好的杂交瘤细胞。

方法：

a.  在培养皿中制备饲养细胞（小鼠腹腔细胞）单层。

b.  临用前将2.0%琼脂糖生理盐水溶液与等量双倍浓度的HT培养液混匀，配成1%琼脂糖培养液，45℃水浴中温育。

c.  吸去平皿上层培养液，加入1%琼脂糖培养液3ml，室温10分钟。

d.  取杂交瘤细胞悬液1ml，加入1%琼脂糖培养液1ml混匀，铺于上层。

e.  37℃、7.5%湿润培养7-14天；克隆生长至2mm时，用毛细吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的24孔板，扩大培养。

f.  吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，或扩大培养、冻存。