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张苏明教授报道：干细胞治疗现状与问题

（图　张苏明教授在做报告）


（图　报告幻灯）


（图　报告幻灯）


（图　报告幻灯）


（图　报告幻灯）

神经与脑血管疾病干细胞生物学治疗研究中存在的主要问题、可能的策略与展望

张苏明

华中科技大学同济医学院附属同济医院

    本文简要重点总结了目前干细胞生物学治疗运用于神经系统疾病研究进展中存在的主要基本问题、探索性策略与展望。

    一、成体干细胞研究新认识、存在的问题与展望

    (一)、成体干细胞“横向分化”理论上的误区
    一些报道认为，在许多成体组织中有一些细胞可以在体外被某些细胞因子诱导分化，变为和原组织不同的组织细胞，例如肌肉匀浆中诱导发生的造血细胞、脂肪组织中诱导发生的神经元细胞等。只是这些由于这些作者们当时尚缺乏对成体干细胞正确认知，错误地认为是组织细胞“横向分化”的结果，故而对这些重大的发现却下了错误的结论。事实上，他们已经发现：在成体组织中仍然残存胚胎发育过程中的、包括各胚层定向的、组织定向的各类干细胞。原来在胚胎发育的每个阶段都有少部分干细胞中止参与胚胎发育，它们都转入GO静止期，既不增殖又不分化却仍然保持干细胞原有的基本特性。当胚胎不断发育成长，而那些不参与胚胎发育的处于静止状态的各类成体干细胞，却依然遗留在机体的各种组织中。出生后随年龄的增长，各种成体组织中仍保留各种类成体干细胞的基本特征不变。在体外适当的细胞因子诱导刺激下，它们可以从GO期转入细胞周期而增殖，而且分化成为某种组织的定向细胞，而并未发生所谓横向分化。

    (二)、成体干细胞与胚胎干细胞在细胞医疗应用研究方面的比较
    比较两者，成体干细胞(adult stem cell)由于来源稀少，难以识别、分离和纯化，易老化和伦理性限制等，在很多干细胞类型中，非常不易获得足够的细胞数量，因此在成体干细胞源的工程化细胞移植在临床上应用无论是现实还是将来都受到了很大的限制。而胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)由于其具有全能性和高度的未分化性，可在体外无限扩增，又易于遗传操作，在一定条件下可被定向诱导生成三个胚层的细胞，当前全球研究干细胞的重心都在：ESC，然而美国的人类ESC研究进展严重受累于布什的现行保守国策。佛州小组进行了有关老鼠干细胞研究的比较实验，一组试验利用从成年老鼠骨髓中提取的干细胞；另一组利用从老鼠胚胎中提取的干细胞。研究人员对比两者，本来希望从实验骨髓中提取的干细胞能够分化成原始细胞，如骨髓组织细胞，直至生长成所需要的其他组织或器官。结果是，骨髓干细胞起初分化顺利，但最终并没有分化成原始细胞，却产生了奇怪的类似人体肿瘤内的细胞。另外苏格兰爱汀堡大学的科研小组，利用从脑细胞中提取的干细胞与胚胎干细胞进行分组比较实验，也发现了类似的问题。研究者认为，如果有关人体干细胞试验出现这样的情况，从成年人体的骨髓、大脑等提取的干细胞，分化形成的新细胞或转化的组织将不适用于治疗疾病，而胚胎干细胞的研究则显示出较好的医学前景。随着临床应用研究的深入，无疑人们会越来越关注成体干细胞的生物安全性问题。

    (三)、将成纤维细胞转化为“万能细胞”的研究突破与病人特异性多能干细胞研发与策略 
    来自美国和日本的三个独立科研小组2007年6月6日报告说，对正常小鼠细胞进行基因重组改造，能够成功制造出“胚胎干细胞”。这项研究由美国哈佛干细胞研究所、怀特黑德生物医学研究所和日本京都大学三个机构的研究人员共同完成。相关研究结果已刊登在新创刊的《细胞·干细胞》杂志和《自然》杂志网站上。如果这一实验能够在人类身上试验成功，就将回避长期以来围绕人类胚胎使用问题的政治和伦理争论，因此被认为是干细胞研究领域的一项重大突破。科学界一直希望找到一种方法，能够不损坏胚胎提取干细胞或者找到胚胎干细胞的替代品，这次的实验就是一个有益的尝试。如果在人类身上也能取得成功，就不必再为治疗目的损坏人类胚胎，那么长期以来围绕这一问题的伦理争论和医学政策就将不存在了。

    (四)、粒细胞集落刺激因子与成体干细胞
    粒细胞集落刺激因子(G一CSF)是骨髓干细胞强有力的动员剂，可以将大量骨髓干细胞动员到外周血中，既有利于外周血获得足够数量的干细胞，也有利于干细胞“自发”地向损伤组织“归巢”，在特定的病理环境下向损伤组织细胞分化修复受损的组织及改善其功能。研究发现，G-CSF通过动员骨髓干细胞，可以对损伤肾脏、胰腺、血液系统等产生修复作用，包括对神经系统。但也存在一些可能的严重副反应：1、G-CSF动员造血干细胞导致WBC急剧升高，还对凝血、抗凝血系统有较大影响，引起高凝状态，将会增加急性心肌梗死等的发生率；2、临床上G-CSF对正常供者可能造成的远期影响逐渐引起学者们的重视，尤其是正常供者使用G-CSF后是否增加患白血病和其他恶性肿瘤的危险。已有研究发现许多肿瘤细胞能合成G-CSF，并且G-CSF能促进某些肿瘤细胞的生长和转移。G-CSF是否引起体内已存的恶性粒细胞增殖等问题有待解决，需大样本长期追踪观察研究。3、临床应用时还应注意的是，G-CSF可导致特殊的类白血病反应，即外周血出现幼稚细胞，骨髓中原始细胞数量增加，但这种现象呈一过性，应注意结合病史进行判断分析，并进一步探讨发生机制。

    (五)、嗅鞘细胞(OECS)的应用性研究概况
    无论从发育起源还是从形态以及免疫组化特性上分析，OECs都是介于雪旺氏细胞和星形胶质细胞之间的单独一类性质独特的胶质细胞类型。在成年期OECs的微丝中，Vimentin是主要组成成分，这就暗示着这种细胞并没有完全转化为“成熟”的表型，这似乎可以解释这种细胞的促轴突生长的特性。OECs的促神经再生作用可能通过以下途径发挥作用。(1)OECs分泌神经营养因子：NTF、BNTF和神经肽Y(netlropeptide Y)等，这些都是神经元生长和存活必需因子；(2)OECs细胞膜表面有细胞粘连分子(层粘连蛋白、L1和N—CAM等)表达；(3)OECs还能够产生促进轴突生长的神经连接素(nexin)和S100等因子。因此，它在成年期仍能够伴随再生轴突迁移并形成鞘包裹轴突。
    目前在OECs的研究中却面临诸多问题：1、OECs培养来源困难：最近几年已经有人成功的从人类的嗅球和嗅粘膜组织分离出OECs，甚至以自体移植的方法用于治疗脊髓损伤的患者，观察到了短期有益的临床疗效。这使我们看到了可能的相对便捷的获取OECs途径，为临床应用迈出了重要一步。2、不同培养条件也对嗅鞘细胞亚型产生影响。3、OECs原代培养的纯化问题。

    二、胚胎干细胞现有关键性问题的研究进展与展望

    (一)、胚胎干细胞(ESCs)的免疫原性与细胞移植细胞移植与组织器官移植一样，也可能发生移植排斥反应。在进行移植治疗的过程中，由主要组织相容性复合物(MHC，在人类则称为人类白细胞抗原)一I类分子引起的CD8+CTL细胞识别的严重程度与细胞表面MHC—I类分子表达水平有关，但供者体内这种直接的排斥反应会随着细胞MHC—I分子的逐渐耗竭而减弱。而且由MHC—I引起的直接排斥反应较容易被免疫抑制剂抑制，而由II类分子激活的CD4+一Thl迟发性超敏反应，则通常不易受到免疫抑制剂影响，因而导致长期的免疫细胞浸润及炎症因子的释放。
    我们的体外研究发现hESCs表面仅有少量的HLA—I类分子表达，几乎没有HLA—II类分子的表达。由hESCs诱导分化而来的神经干细胞(NSCs)表面HLA—I、II类分子的表达均有轻度的增加，但HLA—II类分子的表达仍非常少。IFN-r的诱导作用可上调NSCs表面HLA—I和HLA—II类分子的表达。进一步的实验通过混合淋巴细胞反应模拟同种异体移植的体内环境，经。IFN-r诱导后NSCs表面表达的相对较高水平的HLA—I和HLA—II类分子可刺激与其不同源的淋巴细胞发生明显的增殖反应。提示hESCs及其衍生的NSCs具有较弱的免疫原性，如果将其进行细胞移植治疗，在特定的炎性环境中移植细胞可能会受到宿主的免疫排斥，在将来的细胞移植治疗过程中可能有必要采取针对性的措施。

    (二)、胚胎干细胞衍生的神经前体细胞移植后成瘤性研究
    一方面胚胎干细胞是一种具有无限增殖能力，可以向3个胚层分化的全能性细胞，因此给移植医学带来了似乎无限的移植细胞来源，在将来可以用于治疗多种疾病，尤其是一些无法或者难以获取的细胞，例如。神经前体细胞、胰岛细胞等，但是另一方面，它们无限的自我更新和高度分化潜能在移植后有成瘤危险，因此，可能限制了其直接应用。目前胚胎干细胞衍生的神经前体细胞移植后在成瘤性方面仍有一系列问题有待解决。

    (三)、ESC获取方法与培养体系的改良与优化
    1、ESC获取新方法：2007年美国马萨诸塞州一家公司科学家罗伯特·兰扎等人利用在试管受精中的人类胚胎产生了两个干细胞株。过去提取干细胞的方法会破坏弱小的胚胎。现在采用这种特殊的技术，每次从胚胎中只提取单一的细胞，使胚胎未受到干扰，仍然可以发育成足月的婴儿，同时提取的单个细胞也能够培育成为干细胞链。也就是说，采用这种方法既能够获得干细胞，同时又不会破坏胚胎。科学家们已经证实，从老鼠的试管受精胚胎中提取干细胞后，这些胚胎仍然能够在子宫内正常发育生长(发表于近期《自然》杂志)。现在能够在不破坏胚胎的情况下，得到用于疾病治疗的干细胞株，将有助于解决伦理问题，有利于疾病的治疗。并可能为某个个体终生保留自身的干细胞株，以备后用。
    2、人胚胎干细胞(HESCs)最佳的培养体系的研究：自1998年人胚胎干细胞(HESCs)建系以来，对其培养的研究一直是一个热点，人们进行了大量的探索。试图寻找一种最佳的培养体系。最初To—mas使用的方法是MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)做饲养层，在培养液中添加胎牛血清。这种培养方法可以将HESCs传至数百代而保持其自身性质和遗传学性状不变，是到目前为止世界各地干细胞实验室仍然常用的方法。但是此方法存在很多问题，主要是异源物质的可能污染和培养程序极为烦琐复杂，因此严重限制了HESCs的工程化研发，使其难以应用于临床和相关研究。在今后的研究当中，一方面我们要继续不断尝试其他可能的培养方法，特别是无饲养层无血清的培养，探索是否还有更加有利的选择。另一方面，应努力从分子水平阐明HESCs得以维持其全能性和自我更新能力的机制，以及相关细胞因子的作用机制、信号途径，从而引导我们开发最为优化且成分明确的培养体系，实现临床细胞移植治疗的目标。