手把手教你使用Imagepro-Plus（九）——讨厌的光密度
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我在前面曾经说过光密度较正很难作得准确，吃力不讨好。因此想回避它。但最近却发现这个问题回避不了。只好老老实实地再琢磨一下。真的很伤脑筋，其中有些问题也是百思不得其解。只能把基本上弄明白的地方先给讲解一下，这样大家在看的时候可就费力了，真是不好意思。其实我觉得给别人讲解就是一种最好的学习方法。能够给别人讲解清楚了，才是真正弄明白了。
在计算光密度过程中出现的问题来自于图片的光强单位与测量中的光密度单位的不一致。在计算机的图片格式中，一点象点的“亮”与“暗”是通过定义相素点的“灰度”来实现的。纯黑的点的“亮度”为零。定义其灰度gray=0。纯白点的“亮度”为255。定义其灰度gray=255。
光密度则是光学测量中的概念。OD值（optical density）叫光学密度，定义为吸收光线物质的光学密度，它与该物质的物理密度应该是线性相关的。OD值与透过它的光强之间的关系符合朗伯-比尔定律，是指数关系。当OD值等于0的时候，对光线无吸收，透射率100%。对应照片上最亮的部位，白色，gray=255。当OD值等于无穷大的时候，会吸收全部光线，透射率为0。对应照片上最黑的部位，gray=0
在未进行intensity校正的情况下，IPP用的是gray灰度单位。浅色处灰度值大，深色处灰度值小。这样测出的density数值是染色深的阳性区域数值小，染色浅的背景区域数值大。这就带来了极大的不方便，很容易就出现错误。还有问题呢。因为光强与光密度之间是指数关系。在光密度不大的时候（阳性区域染色浅）阳性区域的density数值与背景density数值都处于较高水平，相差很小，作了减法以后误差增大，扣背景时就会出现极大的误差，而且造成统计数据的效果混乱。
当我们使用IOD（累积光密度=area * density_mean）表达切片上阳性物总量时，如果错用了灰度值。IOD的数值与染色深浅就成了负相关，也就是染色越深，IOD反而更小，但同时，面积越大，IOD仍然越大，这个错误的IOD值就根本不能反映“照片上阳性物质总量”了。因此在作光密度分析时必须对程序系统的光密度值进行转换，从灰度数值转换为光密度数值单位。在平时，很多人并不清楚灰度与光密度之间的异同，甚至在发表的文献上也是胡乱使用这两个不同的概念。由上面的分析我们可以看出，实际上灰度是我们用电脑进行图象分析时所用的中间变量。而光密度才是我们真正需要使用的单位。我们是通过对照片的灰度进行分析来测量样品的光密度的。
在未定义光密度校正的情况下，density mean与IOD的数值实际上都是照片的gray值。gray与OD值的换算公式就是朗伯-比尔定律，是指数关系。我们进行光密度校正的目的就是让照片上亮的、白的、染色浅的点的OD值显示为接近于零的小的数值，让暗的、黑的、染色深的阳性区域点的OD值显示为较大的数值。
对于光密度的校正有两个层次。第一个层次是按照照片的灰度值直接换算。灰度为零的换算为无穷大，灰度为255的换算为0。
第二个层次是考虑到照片的实际情况，把照片最“白”的地方（灰度值小于255）定义为OD=0。这实际就是一个扣除背景的操作。相当于在分光光度计上调整“100%”点，再把照片中最“黑”的地方定义为一个大于零的值。一般定义为2.0（定义为无穷大是作不到的）。或者用标准样品的光密度点直接定义其为样品浓度的值。这相当于在分光光度计上定义零点和标准点。
校正光密度的具体方法如下：
1.点measure - calibaration - intensity....（得先打开一张图片才行）。出现的窗口里是空的。注意窗口第四行有一段文字：no system caliberation set。
2.点窗口里的new按纽，新建一个caliberation set，在下面点击std optical density。再点一下左上方的system按纽。这个system是一定要点的，否则这个光密度较正的设置就只作用于这一张图片，对其他的图片不起作用。
3.点close就完事了。这就完成了第一层水平的光密度校正。以后进行光密度分析时，使用的单位就是真正的optical density了。测量的光密度数值与样品浓度呈正比关系，而以前的灰度值是与样品浓度成指数关系的。
4.进一步的校正应该是对“白”点与“黑”点进行定标。定黑点时需要有标准点。可以在切片上帖一片全黑物体，作为标准，或者是定量浓度的样品点，可指定其为浓度的单位。这一点往往作不到。不作也罢。测个相对值就是了。定白点实际上就是扣除空白、扣除背景。把图片上最浅的地方定义为OD=0每张照片上这个值都不会一样的。难道每张照片都要这么来一下吗？不必。在一组照片中，背景虽然不一样但不会差得太多，找一个最大的（最亮的）设为其公用的背景值也是可以的。点option按纽，在弹出的小窗口里有black与intensity两个设置。black就让它为零。点intensity旁边的image按纽，到图片上最“白”的地方点一下，看看值是多少，最好在一组照片的每一张最白处都点一下，看看它们的值相差多少。然后选其中最大的数值填入。OK后可以看到光密度曲线的终点由255变成了你填入的值。
还是作个实例来分析吧。这里有一组八张照片，左边四张是阴性，右边四张是阳性。阳性样品切片染色深。
optical density
1a 400 density mean = 0.06397654 IOD sum = 20145.209 阳性
1b 400 density mean = 0.08162043 IOD sum = 31614.428 阳性
1c 401 density mean = 0.0463396 IOD sum = 19741.533 阳性
1d 401 density mean = 0.0569243 IOD sum = 22324.918 阳性
2a 400 density mean = 0.04021387 IOD sum = 7237.6157 阴性
3a 400 density mean = 0.0427474 IOD sum = 5851.5864 阴性
4a 400 density mean = 0.03572424 IOD sum = 6247.9492 阴性
4b 400 density mean = 0.02794417 IOD sum = 5908.3018 阴性
P= 0.033001713 P= 0.008077167
gray level
1a 400 density mean = 164.25151 IOD sum = 21893180 阳性
1b 400 density mean = 154.83362 IOD sum = 24106100 阳性
1c 401 density mean = 173.0679 IOD sum = 24422198 阳性
1d 401 density mean = 170.82968 IOD sum = 22868880 阳性
2a 400 density mean = 180.78764 IOD sum = 24721144 阴性
3a 400 density mean = 180.44046 IOD sum = 18576882 阴性
4a 400 density mean = 210.87852 IOD sum = 16926544 阴性
4b 400 density mean = 188.02229 IOD sum = 19494658 阴性
P= 0.034035015 P= 0.135092458
用校正过的optical density测量数据进行统计分析，density mean的差异，P小于0.05。而IOD的差异，P小于0.01。结论是两组照片有显著性差异。用IOD更有效率。
直接用未经校正的gray level的测量数据来分析，density mean的差异，P值小于0.05，数值上略有差别。但IOD却变得没有差异了! P大于0.05。这是为什么？
IOD是阳性面积与阳性平均光密度的乘积，应该是面积越大，IOD越大，光密度越大，IOD越大才对。现在光密度的值是反的，阳性越大，光密度的数值越小，IOD值反而变小，这不是全拧了吗？
可见光密度的校正是必须要作的。至少要作第一层水平的光密度校正。对于背景较暗的要进一步校正“白点”。如果各张照片的亮度差别大，就得分别较正每一张照片的“白点”了。在这个实例中，我是把全部照片的白点都定义为210。
是否要扣背景？这还真不一定。也许扣了背景以后，能使两组之间的差异更明显，也许作不到这一点。这与照片本身有关。
大家一定注意到了火锅的作法与我的作法有点区别。他喜欢把选定的区域转换成灰度图片后再测量。我觉得没有必要。因为彩色图片的density mean与灰度图片的density mean应该是一样的。不过，最后测量的数值却的确有差异！
图中左图是从右图中切出的，其density mean=0.14815767 IOD SUM=16355.301
中图是从左图变为灰度图， 其density mean=0.14364377 IOD SUM=15671.411
特别是IOD，转换成灰度图后的测量值居然有10%的变化，真出乎我的意料之外。不过我觉得这属于系统误差，并不影响测量的整体结论，但我也确实弄不明白这个误差是从哪里来的。
还有一个影响光密度的因素。图中这两张照片是一模一样的吗？只有一点不同，一张是相机上设置了自动白平衡校正。另一张则关闭了这个功能。自动白平衡是数码照相机为了保持照片色彩的均衡的功能。使照片看上去不偏色。可是用染料染色的显微镜照片就偏偏都是有偏色的。它就是需要偏色的。这样数码相机的自动白平衡功能就有点多余了。当你拍摄黄色的免疫组化切片时，相机会认为照片太黄，必须增加点蓝色平衡一下。这就是一些黄色的免疫组化照片上的空白处呈现淡淡的蓝色的原因。这样照片是顺眼了一点，但是背景值的光密度却被增加了，阳性区域的光密度却被减少了。所以拍摄显微镜照片时要关闭相机的自动白平衡功能。特别是要进行光密度分析时，不能使用自动白平衡功能。自动白平衡功能对荧光照片的影响特别大。
在计算光密度过程中出现的问题来自于图片的光强单位与测量中的光密度单位的不一致。在计算机的图片格式中，一点象点的“亮”与“暗”是通过定义相素点的“灰度”来实现的。纯黑的点的“亮度”为零。定义其灰度gray=0。纯白点的“亮度”为255。定义其灰度gray=255。
光密度则是光学测量中的概念。OD值（optical density）叫光学密度，定义为吸收光线物质的光学密度，它与该物质的物理密度应该是线性相关的。OD值与透过它的光强之间的关系符合朗伯-比尔定律，是指数关系。当OD值等于0的时候，对光线无吸收，透射率100%。对应照片上最亮的部位，白色，gray=255。当OD值等于无穷大的时候，会吸收全部光线，透射率为0。对应照片上最黑的部位，gray=0
在未进行intensity校正的情况下，IPP用的是gray灰度单位。浅色处灰度值大，深色处灰度值小。这样测出的density数值是染色深的阳性区域数值小，染色浅的背景区域数值大。这就带来了极大的不方便，很容易就出现错误。还有问题呢。因为光强与光密度之间是指数关系。在光密度不大的时候（阳性区域染色浅）阳性区域的density数值与背景density数值都处于较高水平，相差很小，作了减法以后误差增大，扣背景时就会出现极大的误差，而且造成统计数据的效果混乱。
当我们使用IOD（累积光密度=area * density_mean）表达切片上阳性物总量时，如果错用了灰度值。IOD的数值与染色深浅就成了负相关，也就是染色越深，IOD反而更小，但同时，面积越大，IOD仍然越大，这个错误的IOD值就根本不能反映“照片上阳性物质总量”了。因此在作光密度分析时必须对程序系统的光密度值进行转换，从灰度数值转换为光密度数值单位。在平时，很多人并不清楚灰度与光密度之间的异同，甚至在发表的文献上也是胡乱使用这两个不同的概念。由上面的分析我们可以看出，实际上灰度是我们用电脑进行图象分析时所用的中间变量。而光密度才是我们真正需要使用的单位。我们是通过对照片的灰度进行分析来测量样品的光密度的。
在未定义光密度校正的情况下，density mean与IOD的数值实际上都是照片的gray值。gray与OD值的换算公式就是朗伯-比尔定律，是指数关系。我们进行光密度校正的目的就是让照片上亮的、白的、染色浅的点的OD值显示为接近于零的小的数值，让暗的、黑的、染色深的阳性区域点的OD值显示为较大的数值。
对于光密度的校正有两个层次。第一个层次是按照照片的灰度值直接换算。灰度为零的换算为无穷大，灰度为255的换算为0。
第二个层次是考虑到照片的实际情况，把照片最“白”的地方（灰度值小于255）定义为OD=0。这实际就是一个扣除背景的操作。相当于在分光光度计上调整“100%”点，再把照片中最“黑”的地方定义为一个大于零的值。一般定义为2.0（定义为无穷大是作不到的）。或者用标准样品的光密度点直接定义其为样品浓度的值。这相当于在分光光度计上定义零点和标准点。
校正光密度的具体方法如下：
1.点measure - calibaration - intensity....（得先打开一张图片才行）。出现的窗口里是空的。注意窗口第四行有一段文字：no system caliberation set。
2.点窗口里的new按纽，新建一个caliberation set，在下面点击std optical density。再点一下左上方的system按纽。这个system是一定要点的，否则这个光密度较正的设置就只作用于这一张图片，对其他的图片不起作用。
3.点close就完事了。这就完成了第一层水平的光密度校正。以后进行光密度分析时，使用的单位就是真正的optical density了。测量的光密度数值与样品浓度呈正比关系，而以前的灰度值是与样品浓度成指数关系的。
4.进一步的校正应该是对“白”点与“黑”点进行定标。定黑点时需要有标准点。可以在切片上帖一片全黑物体，作为标准，或者是定量浓度的样品点，可指定其为浓度的单位。这一点往往作不到。不作也罢。测个相对值就是了。定白点实际上就是扣除空白、扣除背景。把图片上最浅的地方定义为OD=0每张照片上这个值都不会一样的。难道每张照片都要这么来一下吗？不必。在一组照片中，背景虽然不一样但不会差得太多，找一个最大的（最亮的）设为其公用的背景值也是可以的。点option按纽，在弹出的小窗口里有black与intensity两个设置。black就让它为零。点intensity旁边的image按纽，到图片上最“白”的地方点一下，看看值是多少，最好在一组照片的每一张最白处都点一下，看看它们的值相差多少。然后选其中最大的数值填入。OK后可以看到光密度曲线的终点由255变成了你填入的值。
还是作个实例来分析吧。这里有一组八张照片，左边四张是阴性，右边四张是阳性。阳性样品切片染色深。
optical density
1a 400 density mean = 0.06397654 IOD sum = 20145.209 阳性
1b 400 density mean = 0.08162043 IOD sum = 31614.428 阳性
1c 401 density mean = 0.0463396 IOD sum = 19741.533 阳性
1d 401 density mean = 0.0569243 IOD sum = 22324.918 阳性
2a 400 density mean = 0.04021387 IOD sum = 7237.6157 阴性
3a 400 density mean = 0.0427474 IOD sum = 5851.5864 阴性
4a 400 density mean = 0.03572424 IOD sum = 6247.9492 阴性
4b 400 density mean = 0.02794417 IOD sum = 5908.3018 阴性
P= 0.033001713 P= 0.008077167
gray level
1a 400 density mean = 164.25151 IOD sum = 21893180 阳性
1b 400 density mean = 154.83362 IOD sum = 24106100 阳性
1c 401 density mean = 173.0679 IOD sum = 24422198 阳性
1d 401 density mean = 170.82968 IOD sum = 22868880 阳性
2a 400 density mean = 180.78764 IOD sum = 24721144 阴性
3a 400 density mean = 180.44046 IOD sum = 18576882 阴性
4a 400 density mean = 210.87852 IOD sum = 16926544 阴性
4b 400 density mean = 188.02229 IOD sum = 19494658 阴性
P= 0.034035015 P= 0.135092458
用校正过的optical density测量数据进行统计分析，density mean的差异，P小于0.05。而IOD的差异，P小于0.01。结论是两组照片有显著性差异。用IOD更有效率。
直接用未经校正的gray level的测量数据来分析，density mean的差异，P值小于0.05，数值上略有差别。但IOD却变得没有差异了! P大于0.05。这是为什么？
IOD是阳性面积与阳性平均光密度的乘积，应该是面积越大，IOD越大，光密度越大，IOD越大才对。现在光密度的值是反的，阳性越大，光密度的数值越小，IOD值反而变小，这不是全拧了吗？
可见光密度的校正是必须要作的。至少要作第一层水平的光密度校正。对于背景较暗的要进一步校正“白点”。如果各张照片的亮度差别大，就得分别较正每一张照片的“白点”了。在这个实例中，我是把全部照片的白点都定义为210。
是否要扣背景？这还真不一定。也许扣了背景以后，能使两组之间的差异更明显，也许作不到这一点。这与照片本身有关。
大家一定注意到了火锅的作法与我的作法有点区别。他喜欢把选定的区域转换成灰度图片后再测量。我觉得没有必要。因为彩色图片的density mean与灰度图片的density mean应该是一样的。不过，最后测量的数值却的确有差异！
图中左图是从右图中切出的，其density mean=0.14815767 IOD SUM=16355.301
中图是从左图变为灰度图， 其density mean=0.14364377 IOD SUM=15671.411
特别是IOD，转换成灰度图后的测量值居然有10%的变化，真出乎我的意料之外。不过我觉得这属于系统误差，并不影响测量的整体结论，但我也确实弄不明白这个误差是从哪里来的。
还有一个影响光密度的因素。图中这两张照片是一模一样的吗？只有一点不同，一张是相机上设置了自动白平衡校正。另一张则关闭了这个功能。自动白平衡是数码照相机为了保持照片色彩的均衡的功能。使照片看上去不偏色。可是用染料染色的显微镜照片就偏偏都是有偏色的。它就是需要偏色的。这样数码相机的自动白平衡功能就有点多余了。当你拍摄黄色的免疫组化切片时，相机会认为照片太黄，必须增加点蓝色平衡一下。这就是一些黄色的免疫组化照片上的空白处呈现淡淡的蓝色的原因。这样照片是顺眼了一点，但是背景值的光密度却被增加了，阳性区域的光密度却被减少了。所以拍摄显微镜照片时要关闭相机的自动白平衡功能。特别是要进行光密度分析时，不能使用自动白平衡功能。自动白平衡功能对荧光照片的影响特别大。
编辑：bluelove
作者: hbchendl
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