手把手教你使用Imagepro-Plus（十）——免疫组化光密度测量
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下面就是统计问题了。现在我们测量的是整张照片中黄色区域的总光密度值。图片与图片之间是否就是比较它们之间的IOD值呢？未必。
最简单的情况是，切片充满整个视野，并没有大片空白。此时IOD值就能反映出这两张图片染色程度的不同。实际上这些照片的测量区域面积都是整张图片（不是黄色区域的面积），其平均光密度就是IOD除以图片的整个面积。实际上比较的就是整个视野的平均光密度。
另一种情况是照片上有空白区域，是没有组织的空白。因此在计算平均光密度时要把这部分面积给扣掉。使用的测量指标应该是切片的平均光密度，计算方法为IOD/（照片面积-空白区域面积）
照片面积就是照片的象素，一张480*720象素的照片面积是345600。空白区域面积得另测一下，选色时把 I 选在250-255之间，H选30-255，再count一下就能测出了。不过这样测有时会把组织内部的小空泡也选进去。这只要在面积测量中设一个大一点的过滤值就行，比如只计算面积大于200象素的区域。还可以看measurement date ，找那个最大的几个object的面积。
如果视野内还有不同类型的组织区域，不应被计算进去，可以用不规则曲线工具选中这些区域，用edit -- filled 把它们填上白色。再进行测量。
还有其他的一些复杂情况，没法一一叙述。一句话，测量的IOD是分子的值，一般情况下都相似，选择的area这个分母在不同的切片上却各有不同，需要看切片的具体情况进行适当选择。本质上比较的指标应该是一个平均光密度（IOD/area）。
当切片较多时，制作一个宏操作能大大省时省力。
制作宏的操作：
一、准备工作：
1.进行光密度较正。命名保存，如system。
2.在count/size窗口中设置：
measurement：area（10-10000000），IOD（0-100000000）
option：outline：none，label style：none .clean border：none
然后点file --save setting，保存该设置为一个文件date.evn，文件位置最好是分析的图片文件夹里
3.在select color 里选HIS：H 0-30，S，I0-255，然后点下面的file按纽，save color到一个rgb24.rge文件，也存到图片文件夹目录中。
二、录制宏：
打开图片，点开count/size窗口，先随便测个数据，这样可以打开view--statistics 窗口，可以随时察看测量数据。再打开intensity caliberation窗口。现在桌面上有光密度较正窗口、count窗口，数据统计值窗口和图片窗口，以此为运行宏的开始。点宏--录制宏，先起个名字，指定一个快捷键。然后开始录制。注意以下的所有操作都只能用鼠标点，不能动任何键。
1.在intensity caliberation窗口中选上已保存过的较正曲线名，注意一下曲线是不是正确，特别是X轴交点位置是不是刚才较正过的值（如200或240之类）
2.点count/size中的file--load setting，调出刚才保存的date.evn文件。
3.点select color，在调出的窗口中点HSI，再点load file，调出rgb24.rge文件。
4.仍然在segmentation窗口中下方的preview中选择 all class 和transparent on white.此时图片上应显示被选中的部分仍是黄色，其他部分被填上了白色。点creat preview image复制下这张preview图片。
5.在新图片上点一下，再点程序菜单上的edit---convert to --gray scale8。又生成一张新图片，这是黑白图片了。
点录制宏小窗口的stop结束。
把这张黑白图片保存。关闭其他的图片，打开Excel,然后开始录制另一个宏：
1.开始录制后依然先点一下intensity caliberation 的那个校正。
2.调出count窗口的setting文件。
3.点select range。将range范围选为：0-背景值（这个背景值就是在校正背景时得到的值，如200或240之类）
4.回到count中点count按纽。
5.到statistics窗口中点file DDE to Excel。
6.结束宏的录制。
说明：由于中间会建立新文件，所以这一步的宏操作常出错。只好分成两步作宏操作。
宏操作录制完后，处理图象时的操作：
1.打开一个图片，运行第一个宏。得到一张灰度图片。
2.对灰度图片执行第二个宏操作。
3.在excel中把数据转移或抄下来。
4.先打开下一张要处理的图片，再关闭掉上一张图片。（桌面上不能一张图片也没有）
5.开始处理下一张图片。
图片测量数据的处理：测量指标要根据图片的情况来选择。各有不同的选取。
可以：
仅比较整张图片的IOD。
比较阳性区域的density mean=IOD（sum）/area（sum） （这里的area是黄色部分的area）
有时图片上仅有部分区域有样品，还有大片区域是空白。这就需要另外测量样品区域的area（sample sum），然后比较IOD（sum）/（sample sum area）
单个细胞可以比较每个细胞的IOD 或者是单个细胞IOD/单个细胞area。这些其他的情况都需要重新制作宏。
编辑：bluelove
最简单的情况是，切片充满整个视野，并没有大片空白。此时IOD值就能反映出这两张图片染色程度的不同。实际上这些照片的测量区域面积都是整张图片（不是黄色区域的面积），其平均光密度就是IOD除以图片的整个面积。实际上比较的就是整个视野的平均光密度。
另一种情况是照片上有空白区域，是没有组织的空白。因此在计算平均光密度时要把这部分面积给扣掉。使用的测量指标应该是切片的平均光密度，计算方法为IOD/（照片面积-空白区域面积）
照片面积就是照片的象素，一张480*720象素的照片面积是345600。空白区域面积得另测一下，选色时把 I 选在250-255之间，H选30-255，再count一下就能测出了。不过这样测有时会把组织内部的小空泡也选进去。这只要在面积测量中设一个大一点的过滤值就行，比如只计算面积大于200象素的区域。还可以看measurement date ，找那个最大的几个object的面积。
如果视野内还有不同类型的组织区域，不应被计算进去，可以用不规则曲线工具选中这些区域，用edit -- filled 把它们填上白色。再进行测量。
还有其他的一些复杂情况，没法一一叙述。一句话，测量的IOD是分子的值，一般情况下都相似，选择的area这个分母在不同的切片上却各有不同，需要看切片的具体情况进行适当选择。本质上比较的指标应该是一个平均光密度（IOD/area）。
当切片较多时，制作一个宏操作能大大省时省力。
制作宏的操作：
一、准备工作：
1.进行光密度较正。命名保存，如system。
2.在count/size窗口中设置：
measurement：area（10-10000000），IOD（0-100000000）
option：outline：none，label style：none .clean border：none
然后点file --save setting，保存该设置为一个文件date.evn，文件位置最好是分析的图片文件夹里
3.在select color 里选HIS：H 0-30，S，I0-255，然后点下面的file按纽，save color到一个rgb24.rge文件，也存到图片文件夹目录中。
二、录制宏：
打开图片，点开count/size窗口，先随便测个数据，这样可以打开view--statistics 窗口，可以随时察看测量数据。再打开intensity caliberation窗口。现在桌面上有光密度较正窗口、count窗口，数据统计值窗口和图片窗口，以此为运行宏的开始。点宏--录制宏，先起个名字，指定一个快捷键。然后开始录制。注意以下的所有操作都只能用鼠标点，不能动任何键。
1.在intensity caliberation窗口中选上已保存过的较正曲线名，注意一下曲线是不是正确，特别是X轴交点位置是不是刚才较正过的值（如200或240之类）
2.点count/size中的file--load setting，调出刚才保存的date.evn文件。
3.点select color，在调出的窗口中点HSI，再点load file，调出rgb24.rge文件。
4.仍然在segmentation窗口中下方的preview中选择 all class 和transparent on white.此时图片上应显示被选中的部分仍是黄色，其他部分被填上了白色。点creat preview image复制下这张preview图片。
5.在新图片上点一下，再点程序菜单上的edit---convert to --gray scale8。又生成一张新图片，这是黑白图片了。
点录制宏小窗口的stop结束。
把这张黑白图片保存。关闭其他的图片，打开Excel,然后开始录制另一个宏：
1.开始录制后依然先点一下intensity caliberation 的那个校正。
2.调出count窗口的setting文件。
3.点select range。将range范围选为：0-背景值（这个背景值就是在校正背景时得到的值，如200或240之类）
4.回到count中点count按纽。
5.到statistics窗口中点file DDE to Excel。
6.结束宏的录制。
说明：由于中间会建立新文件，所以这一步的宏操作常出错。只好分成两步作宏操作。
宏操作录制完后，处理图象时的操作：
1.打开一个图片，运行第一个宏。得到一张灰度图片。
2.对灰度图片执行第二个宏操作。
3.在excel中把数据转移或抄下来。
4.先打开下一张要处理的图片，再关闭掉上一张图片。（桌面上不能一张图片也没有）
5.开始处理下一张图片。
图片测量数据的处理：测量指标要根据图片的情况来选择。各有不同的选取。
可以：
仅比较整张图片的IOD。
比较阳性区域的density mean=IOD（sum）/area（sum） （这里的area是黄色部分的area）
有时图片上仅有部分区域有样品，还有大片区域是空白。这就需要另外测量样品区域的area（sample sum），然后比较IOD（sum）/（sample sum area）
单个细胞可以比较每个细胞的IOD 或者是单个细胞IOD/单个细胞area。这些其他的情况都需要重新制作宏。
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作者: hbchendl
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