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显色（HRP酶）

1．增强化学发光法(ECL)

Ecl 显色原理：氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺（luminol，5＇-氨基-2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮）的分子结构及化学反应式如下：

鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。

试验步骤：

1）将两种显色底物1：1等体积混合（一般各1ml/membrane）。

2）将混合物覆盖在膜表面，1-2分钟，摇晃使均匀。

3）用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中。

4）在暗室中将X光片，覆盖在膜的上面，夹好夹子，曝光1min。

5）显影、定影。

6）根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。

注意：荧光在一段时间后会越来越弱。

2.DAB显色

DAB（3,3二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。

对于AP标记的二抗我们选用BCIP and NBT 显色，它们在碱性磷酸酶（AP）作用下反应可生成一种不溶性黑紫色沉淀的强信号。

Western显色

ECL灵敏度比DAB高不少