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（二）操作方法

1．取血清加等量的0.1Mol/L ZnSO4液，调pH至7.0，室温搅拌1h，离心去沉淀。

2．于上清液中加入等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置30min或冰箱过夜。

3．10 000r/min离心10min，去上清。

4．取沉淀溶于4ml10％EDTA－Na溶液中。

5．生理盐水中透析除盐。

6．过DE52柱，用0.01Mol/L pH7.4PB液洗脱蛋白（IgG）弃去。

7．换用0.1Mol/L pH6.4PB液洗脱，收集蛋白峰，即为IgA。

8．再过SephadexG200柱，洗液为0.01Mol/L pH7.4PBS（0.14Mol/L NaCl），收集洗脱液测OD280值，取第一峰即为纯化IgA。

9．透析、浓缩、鉴定。

四、 分泌型IgA的分离与鉴定

（一）材料与试剂

1．初乳

2．SephadexG200

3．0.10Mol/L pH6.8PB液

4．0.01Mol/L pH7.4PB液

5．DEAE52

（二）操作方法

1．取初乳20ml，10 000rpm离心10min，弃去表面脂肪层及底部的沉淀物。

2．取乳清过SephadexG200柱（柱规格为2.50cm×90cm），以0.10Mol/L pH6.8PB液洗脱，第一峰为IgA（含IgG）。

3． 收集乳液，于0.01Mol/L pH7.4PB液中透析。

4． 将透析液浓缩至5mg/ml以上。

5． 过DE52层析柱，用0.01Mol/L pH7.4PB液洗脱，洗下蛋白峰为IgG，弃去。

6． 换用0.10Mol/L pH6.8PB液或0.01Mol/L pH7.4PBS（0.10Mol/L NaCl）液洗脱，

收集洗脱液 ，即为较纯的IgA液。

7． 必要时，可再过一次SephadexG200柱。

8． 浓缩，鉴定

五、 禽IgA提取与纯化

（一）材料与试剂配制

1．禽胆汁

2．饱和硫酸铵溶液

3．0.01Mol/L pH7.4PBS液

4．0.10Mol/L pH6.4PBS液（0.30Mol/L NaCl）

5． DEAE52-纤维素

（二）操作方法

1．取冷藏的胆汁3Ⅹml，缓慢滴加Ⅹml饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使成25％饱和硫酸铵液。4℃放置30min。

2． 3 000r/min离心30min，去沉淀。

3． 取上清，加饱和硫酸铵液，使成35％的饱和度，4℃放置30min。

4． 3 000r/min离心30min，弃上清。

5． 取沉淀，加0.85％NaCl液溶解，加饱和硫酸铵溶液，重复步骤3和4三次。

6． 将沉淀用0.85％NaCl液溶解，装入透析袋，以0.01Mol/L pH7.4PBS液透析。

7． 以0.01Mol/L pH7.4PBS液平衡，过DEAE52纤维柱（20×250mm）。

8． 取透析样品4ml(﹥20mg/ml蛋白浓度)加入层析柱。以0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱。

9． 再用0.10Mol/L pH6.4PBS液（NaCl浓度为0.30Mol/L）洗脱，收集洗脱液。

10．浓缩洗脱蛋白液至20mg/ml，分装，低温冰箱保存。

六、 IgE的分离与提纯

（一）材料与试剂

1．血清

2．饱和硫酸铵溶液

3．洗脱液0.005Mol/L pH7.4PB液

0.025 Mol/L pH7.4PB液

0.01Mol/L pH7.4PBS液(0.14mol/L NaCl)

4．DE52

5．SephadexG150

（二）操作方法

1．取血清倍比稀释后，加等量饱和（NH4）2SO4溶液，盐析。

2．离心取沉淀，溶于少量生理盐水中，透析、除盐。

3．过DE52柱，以0.005Mol/L pH7.4PB液洗脱，收集洗脱蛋白峰(IgG)，弃去。

4．换以0.025Mol/L pH7.4 PB液洗脱，洗下的蛋白峰主要是IgE。

5．透析除盐。

6．过G150柱，以0.01Mol/L pH7.4PBS(0.14Mol/L NaCl)洗脱，收集洗脱液即为纯化的IgE。

7． 浓缩、鉴定。