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hMSH2、hMLH1、TβRⅡ、E-cad、β-cat、MMP-7、TIMP-2表达在遗传性非息肉病性大肠癌侵袭转移中的作用

顾国利1，王石林1△，魏学明1，任力2，胡益云2，李德昌2
（1空军总医院普外科，北京100036；2病理科）

[摘要] 目的 探讨hMSH2、hMLH1、转化生长因子β Ⅱ型受体（TβRⅡ）、上皮钙黏附蛋白（E-cadherin， E-cad）、β-链接素（β-catenin， β-cat）、基质金属蛋白酶-7（MMP-7）、组织抑制因子-2（TIMP-2）表达与遗传性非息肉病性大肠癌（HNPCC）侵袭转移的关系。方法 应用免疫组化染色法检测HNPCC和散发性大肠癌（sporadic CRC）肿瘤组织石蜡标本各30例、正常大肠黏膜石蜡标本8例。观察其hMSH2、hMLH1、TβRⅡ、E-cad、β-cat、MMP-7、TIMP-2表达的差异；并结合临床病理资料综合分析。结果 hMSH2、hMLH1、TβRⅡ、E-cad、β-cat、MMP-7、TIMP-2的表达与HNPCC和sporadic CRC患者的性别、肿瘤大小和部位无关；而与肿瘤侵犯深度和转移密切相关。两组中hMSH2、hMLH1、TβRⅡ、E-cad、β-cat、MMP-7、TIMP-2的表达率差异显著。hMSH2与hMLH1表达呈正相关；hMSH2和hMLH1与TβRⅡ表达呈正相关；而TβRⅡ与MMP-7表达呈正相关，与TIMP-2表达呈负相关。E-cad和膜表达β-cat呈正相关，而膜表达β-cat和浆表达β-cat呈负相关，浆表达β-cat和MMP-7呈正相关。MMP-7与TIMP-2表达呈负相关。结论 错配修复基因（MMR）的突变（主要是hMSH2、hMLH1）在引起HNPCC发病的同时，也引起了下游基因TβRⅡ的突变失活；而TβRⅡ的突变失活将使HNPCC逃逸TGFβ1对早期肿瘤的抑制作用，这可能是HNPCC发病早、病理分化差、多原发癌多见的一个原因。TβRⅡ的突变失活也使TGFβ1降解E-cad、膜表达β-cat的能力下降。从而使HNPCC中浆表达β-cat的表达减弱，使其诱导MMP-7表达的作用减弱。这可能是HNPCC侵袭弱、转移少、预后较好的一个原因。
[关键词]结肠直肠肿瘤，遗传性非息肉性；突变；免疫组织化学
[中图分类号]R574.62 [文献标识码]A

Expressions of hMSH2、hMLH1、TβRⅡ、E-cad、β-cat、MMP-7、TIMP-2 and their correlation to the biological behaviours of hereditary nonpolyposis colorectal cancer

GU Guo-li1, WANG Shi-lin1△, WEI Xue-ming1, REN Li2, HU Yi-yun2, LI De-chang2. （1Department of General Surgery, General Hospital of Air force PLA, Beijing 100036, China. 2 Department of Pathology ）

Abstract: [Objective]  Hereditary nonpolyposis colorectal cancer （HNPCC） is an important subgroup of colorectal carcinomas. Compare to sporadic colorectal cancer（sporadic CRC）, HNPCC present several particular features, the most important of which are less invasive and metastatic properties linked to a more favorable prognosis.The aim of our study is to investigate the correlation of hMSH2, hMLH1, transforming growth factor β receptor type II（TβRⅡ）, E-cadherin （E-cad）, β-catenin （β-cat）, matrix metalloproteinase-7（MMP-7） and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 （TIMP-2） expression with biological behaviours of human hereditary nonpolyposis colorectal cancer（HNPCC）. [Methods] The expressions of hMSH2, hMLH1, T?RⅡ, E-cad, β-cat, MMP-7 and TIMP-2 protein were detected by immunohistochemical staining in tumors tissue including 30 cases of sporadic colorectal cancer（sporadic CRC）, 30 cases of HNPCC and 8 cases of normal colorectal mucous membrane. And their clinical data were studied retrospectively. [Results] The positive expression rates of hMSH2,hMLH1,TβRⅡ,E-cad,β-cat,MMP-7 and TIMP-2 were significantly related to the depth of invasion and lymph node metastasis, but not to the sex and the size or position of the tumour. The discrepancy of positive expression rate of hMSH2,hMLH1,TβRⅡ,E-cad,β-cat,MMP-7 and TIMP-2 were remarkable between in sporadic CRC and in HNPCC. The expression of hMSH2 had a positive correlation with hMLH1 in HNPCC and sporadic CRC. The expression of TβRⅡ had a positive correlation with hMSH2, hMLH1 and MMP-7, and negative correlation with TIMP-2. The expression of MMP-7 had a negative correlation with TIMP-2 in HNPCC and sporadic CRC. The expression of E-cad positively correlated with β-cat in membrance. However, the expression of β-cat in membrance negatively correlated with β-cat in plasma, and the expression of β-cat in plasma positively correlated with MMP-7.[Conclusions] The mutation of mismatch repair gene（MMR）,mainly hMSH2 and hMLH1, also beget the mutational inactivation of TβRⅡ while they cause HNPCC. So HNPCC tumours can escape the inhibition of TGFβ1. However TGFβ1 can induce the expression of MMP-7 and down-regulate the expression of TIMP-2 in tumors via E-cad and β-cat. This might be one reason of special biological behaviours of HNPCC.

Key words Colorectal neoplasm, hereditary nonpolyposis; Mutation; Immunohistochemistry

遗传性非息肉病性大肠癌（hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC）是一种显性遗传综合征[1]。相对于散发性大肠癌（sporadic colorectal carcinoma，sporadic CRC），HNPCC的遗传病因特殊、临床病理特点突出[2-4]。研究发现：HNPCC发病年龄早、病理分化差、多原发癌多见，但其预后却明显好于sporadic CRC [5，6]。原因[7]：在获得诊断时HNPCC比sporadic CRC的侵袭更弱、转移更少。诸多因素参与大肠癌的发生发展和侵袭转移；其中转化生长因子β（TGFβ）/Smad和Wnt/β-链接素（β-catenin， β-cat）信息通路在其中扮演着非常重要的角色。两者都参与诱导肿瘤的生长分化，继而影响侵袭转移。TGFβ1与细胞膜上的Ⅱ型受体（TβRⅡ）结合是TGFβ/Smad信息通路的启动环节[8]，而β-cat是Wnt/β-cat信息通路的关键因子。其既可与细胞膜的上皮钙黏附蛋白（E-cadherin， E-cad）结合参与介导上皮细胞黏附、保持肿瘤组织的完整性、阻止肿瘤细胞脱离原发灶、抑制肿瘤转移，又可进入胞浆、胞核中启动Wnt/β-cat信息通路的下游靶基因。基质金属蛋白酶-7（MMP-7）就是一个靶基因产物。MMP-7可直接参与分解基底膜和细胞外基质造成肿瘤侵袭、转移;同时MMP-7也参与胞膜中E-cad和β-cat的分解，加速β-cat在胞浆中的积累表达[9]。而组织抑制因子-2（tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）则是MMP-7的特异性抑制物[10]。我们采用免疫组织化学SP染色法检测hMSH2、hMLH1、TβRⅡ、E-cad、β-cat、MMP-7、TIMP-2在HNPCC、sporadic CRC和正常大肠黏膜中的表达，探讨其与HNPCC上述特殊生物学行为之间的关系。

1 资料与方法

1.1.临床资料：选取1980年5月至2005年6月北京空军总医院普通外科收治的HNPCC病例30例组成试验组，全部病例均符合AmsterdamⅡ标准[11]。随机选取同期收治的年龄≥60岁的、没有家族遗传倾向和多原发癌的sporadic CRC病例30例组成阳性对照组，选取8例正常大肠黏膜组织组成阴性对照组。具体临床资料见表1。三组的年龄差异有统计学意义（P＜0.05）。

1.2.试验材料及方法：选取HNPCC、sporadic CRC病例的大肠癌组织石蜡块和正常大肠黏膜组织石蜡块切片染色。上述标本均经HE染色确诊。TβRⅡ兔抗人多克隆抗体（sc-400）购自Santa Cruz Biotechnology公司；hMLH1鼠抗人单克隆抗体（ZM-0154）、hMSH2鼠抗人单克隆抗体（ZM-0156）、E-cad鼠抗人单克隆抗体（ZM-0092）、β-cat鼠抗人单克隆抗体（ZM-0442）、MMP-7鼠抗人单克隆抗体（ZM-0334）、TIMP-2鼠抗人单克隆抗体（ZM-0431）工作液、SP试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物公司。试验由LAB vision Autostainer360自动染色仪系统（福建迈新公司）程控完成、镜下图像以Olympus Dp70图像采集分析仪采集。采用免疫组织化学SP染色法[7]，hMSH2、hMLH1、TβRⅡ、E-cad、β-cat组和TIMP-2以1mmol/L的EDTA缓冲液微波修复5min，MMP-7组不需修复。磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照，已知阳性切片作阳性对照。在200倍的视野下随机选取10个视野，记数每个视野中细胞的染色情况，取平均值。E-cad定位于细胞膜;胞膜阳性细胞数≥70%记为E-cad阳性。从细胞膜、细胞质两方面观察β-cat的表达[2]，胞膜阳性细胞数≥70%记为β-cat膜表达阳性，胞质阳性细胞数>30%记为β-cat浆表达阳性。hMLH1、TβRⅡ、MMP-7、TIMP-2均定位于细胞浆，hMSH2定位于细胞核。依据染色强度和阳性细胞率来计算评分。染色强度：0为无染色；1为染色弱；2为中等染色强度；3为染色强。阳性细胞率：0为＜1%，1为＜10%，2为＜50%，3为＜80%，4为≥80%。以染色强度与阳性细胞率之和计算评分，0~2分为阴性（－），3~5分为阳性（+），6~7分为强阳性（++）。评分过程由两名高年资病理科医生独立完成。

1.3.统计学分析：应用SPSS 13.0统计软件包进行统计分析。计数资料采用两个（或多个）样本率比较的c2检验，正态分布的计量资料采用随机设计的两总体均数的t检验，偏态分布的计量资料采用两组完全随机设计的Mann-Whitney秩和检验。积分相关性采用Spearman等级相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hMSH2、hMLH1、TβRⅡ、E-cad、β-cat、MMP-7、TIMP-2蛋白在三组中的表达特征：hMLH1、TβRⅡ、MMP-7、TIMP-2蛋白均呈棕黄色颗粒表达于细胞浆，弥漫性分布，肿瘤间质不染色或浅染。hMSH2蛋白呈棕褐色颗粒表达于细胞核，局灶性分布，部分胞浆轻染。E-cad、β-cat蛋白呈棕黄色细颗粒状表达于上皮细胞间接触侧的胞膜上，β-cat蛋白也可在胞质表达;肿瘤间质不染色。hMLH1、TβRⅡ、E-cad、β-cat、MMP-7的染色强度高于hMSH2和TIMP-2的表达。hMSH2、hMLH1、TβRⅡ、MMP-7、TIMP-2蛋白在三组中的表达情况见表2。除sporadic CRC和正常黏膜两组中TIMP-2表达的c2检验无显著性差异外，其余相关项目间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 hMSH2、hMLH1、TβRⅡ、E-cad、β-cat、MMP-7、TIMP-2表达水平与HNPCC和sporadic CRC临床病理参数之间的关系：由表3可知HNPCC和sporadic CRC两组间hMSH2、hMLH1与病人的年龄、性别、肿瘤大小和部位及侵袭深度及转移与否等方面差异显著。HNPCC和sporadic CRC两组间的T?RⅡ、E-cad、β-cat、MMP-7、TIMP-2阳性表达率均与病人性别及肿瘤的大小、部位无明显关系（P＞0.05），而与肿瘤的侵犯深度和是否转移密切相关。即：TβRⅡ、E-cad、β-cat、MMP-7、TIMP-2的表达与HNPCC和sporadic CRC的Dukes分期密切相关。浆表达β-cat、MMP-7在侵犯浆膜外组织和有转移者的阳性表达率明显高于侵犯限于浆膜和无转移者（P＜0.05）。而TβRⅡ、E-cad、膜表达β-cat、TIMP-2在侵犯限于浆膜和无转移者中的阳性率明显高于侵犯浆膜外组织和有转移者（P＜0.05）。