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Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。

Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇-水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。正相系统以氯仿-甲醇最为常见，先用50％氯仿-甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。

如果样品极性大，请选用反相溶剂洗脱（甲醇-水），样品用最少体积的甲醇-水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要过滤！如果堵住了Sephadex LH20，就得将Sephadex LH20的柱头部分弃去，很可惜）。如果样品极性小，就选用正相溶剂洗脱（氯仿-甲醇），样品用最少体积的氯仿-甲醇溶解，过滤后，湿法上样。

我的分离技巧有：（1） 流速不可太快，切切不可性急，所谓欲速则不达。（2）柱子尽可能长， Sephadex LH20柱长的增加将极大地改善分离，不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。要集中优势兵力，打击敌人。（3）馏分一定要接的细，可1/10，或1/20 个保留体积接成一馏分。（4） 洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。（5）鞣质成分死吸附严重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣质。（6）Sephadex LH20对黄酮类成分的分离效果极佳，方法很成型，有大量文献参考。（7）填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来，待用。

Sephadex LH20在不同的溶剂中的吸涨程度是不同的（任何填料都是这样，只是Sephadex LH20更明显），一般在丙酮，乙酸乙酯中收缩很厉害，所以一般不用丙酮，乙酸乙酯作溶剂，如果前后使用的两种洗脱溶剂对Sephadex LH20的吸涨程度相差很大，还会产生大量气泡。以下列举了1g干态的，Sephadex LH20对不同溶剂中的保留体积：

water 2.1ml
MeOH 1.9ml
EtOH 1.8ml
CHCl3 1.6ml
n-BuOH 1.6ml
丙酮 0.8ml
乙酸乙酯 0.4ml
甲苯 0.2ml

样品的溶解最好与洗脱的起始浓度相同，但多数情况下都办不到。对Sephadex LH20上样样品的要求是1、样品一定要溶解（Sephadex LH20很贵，要保护填料；同时，避免样品不溶解造成的脱尾）。2、溶解样品的体积尽可能小（色谱分离理论的基本要求，减小原始谱带宽度）3、样品的溶解最好与洗脱的起使浓度相同（若样品的溶解溶剂比洗脱的起使浓度洗脱能力强，则会人为增加洗脱起使溶剂的洗脱能力；同时若样品的溶解溶剂与洗脱的起使溶剂差别很大，样品可能以为溶解性的问题而析出）。以上三点是上样的基本要求，有时很难求全，只有根据具体的实际来决定了。一般我的做法是满足1，2点，尽量满足第三点，“如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇-水），样品用最少体积的甲醇-水（尽可能甲醇少一些）溶解”，请注意我的陈述是“尽可能”。

在分离过程中如果要分离的样品量很大，而柱层填料相对较少的情况是很多的。一般解决的途径有两条：1）将样品一次全上柱，这样分离效果一定不会好，但我们的侧略是将样品交叠的部分再上一遍或几遍，这叫反复xxxx柱层，好处是工作量小（对比下面就知道了），在前后较纯的馏分，如果目标组分量足够，效果就更好。2 ）将样品分几次分别分离，这样每次分离的效果一定比将样品一次全上柱的分离效果好，但这样有一个很大的弊病，就是每次柱层的条件不可能保持完全一致，这样几次柱层分离的馏分间的重现性就存在很大问题，再将几个分开上的柱层馏分合并的过程中，合的太粗，就如同将样品一次全上柱的合并结果，只是工作量增大了。如果心中不甘，你中有我我中有你的馏分，我也不知怎么合并了。所以推荐的做法是将样品一次全上柱，再通过反复柱层的方法来逐步提高分离效果。一般Sephadex LH20上样体积具体也没有明确的规定，大约为柱床体积的1/10。

样品经过分离一般而言会产生两种结果：1、目标组分的相对纯度提高，因为经过分离后各组份分别在不同的馏分富集，当然在富集目标组分的馏分中目标组分的含量要比总样中的含量要高，所以我们说目标组分得以纯化。2、目标组分的绝对量减少，因为无论是什么分离手段，物质的分离总会有交叉，意即不但目标组分分布于主要富集目标组分的馏分中，相邻馏分中也定会有它的踪影，只是可能不是相邻馏分的主成分，从分离的角度，那些相邻馏分并非是我们想要的，我们只将目标组分的相对含量高的馏分用于下一步分离，这种结果必然是与原样相比用于下一步分离的馏分中目标组分的绝对量要少一些。

实验中如何蒸干甲醇水呢？像水这种高沸点的溶剂是比较难蒸干的，但办法是有的。我们可以先看看旋转薄膜的几个要素：真空度， 冷凝液， 蒸发温度。1） 真空度决定于水泵的效率和系统的密闭性。一般的国产水泵就能满足日常的需要（包括蒸水），但一定注意的是水泵的循环水一定要开，如果不开循环水，水泵中的水很快就会变得很热，将极大地减少水泵的效率，且会将抽出的溶剂挥散出来，很不好! 比国产水泵更好的是进口水泵，比进口水泵更好的是隔膜泵，系统的密闭性就更重要了，特别是蒸像水，丁醇这样的溶剂，对系统的密闭性的要求很高，对于系统密闭性不好时，可采用逐步拆分法来查漏，最容易出问题的地方在垫圈，国产的旋转薄膜配的垫圈很烂，全不耐氯仿等有机溶剂，当用国产的旋转薄膜蒸过氯仿等有机溶剂，垫圈就废了。所以要多预备几个垫圈。2） 冷凝液一般使用水，如果配一台冷阱，使用半量的水配比上办量的汽车冷冻液， 效果很好。3） 提高蒸发温度当然可以提高蒸发的效率，但可能发生物质的变化，国产旋转薄膜，水泵，用水冷，当然就只好提高蒸发温度了。

如果Sephadex LH20柱子被弄脏了，大多数情况下是由于样品没滤， 将柱头堵住，或由于样品的死吸附（一般很少发生），使柱子的柱头部分污染，一般的处理是将被污染的柱头部分的填料弃去，具体做法很简单，只将被污染的柱头部分的填料用玻棒轻轻搅起，倒掉即可。如果柱子整个被污染，如果是将Sephadex LH20用反相被污染，办法如下：依次用水，NaOH-NaCl水溶液，水，甲醇洗涤被污染的柱子。因为是整个柱子被污染，所以污染物一定不会完全死吸附在柱上（如果完全死吸附在柱上，污染物一定会只在柱头部分），所以用合适的溶剂一定可以将之洗下来。

在更换洗脱溶剂或进行调料再生时，需要特别注意溶剂更换的梯度不可以太大，以避免柱层中出现气泡或镂空。如果发现柱层时样品色带的走行出现明显的速度不一致，建议重装柱子。

NaOH-NaCl水溶液配法： 8g NaOH 、30g NaCl、1000ml 水

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