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培养基
EB
配制一20×不含DMEM，FBS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于ES培养基--见前述）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。将21ml该溶液和50ml FBS加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。
贮存液          
DMEM(高糖)          
胎牛血清          
L-谷氨酰胺（200mM）          
MEM NEAA（10mM）          
HEPES（1M）          
β-巯基乙醇（55Mm）          
PEST（P104U/mlS104μg/ml          

ITSFn and N3：
配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分装在15ml FALCON管中，（稀释为1×，ITSFn 7.05ml，N3 12.55ml），0.2μm滤膜过滤，贮存在-20℃。将该溶液加入DMEM/F12中制备培养基，贮存于4℃。
贮存液          
DMEM(高糖)          
转铁蛋白50mg/ml          
胰岛素5mg/ml          
亚硒酸钠300μM          
黄体酮（20μM）          
腐胺（100μM）          
PEST（P104U/ml S104μg/ml）          
层粘连蛋白100μg/ml          
纤维连接蛋白250μg/ml           
碱性rhFGF, 10μg/ml          
*在第4步将bFGF加入N3培养基使终浓度为10ng/ml。

ITSFn and N3培养基贮存液的准备
使用无菌的溶剂和稀释液，在分装之前要对溶液进行过滤，如果因为某些原因溶液在分装之前没有进行过滤，需要在管子上标明以便别人在使用时知道该溶液不能直接用于细胞培养。
贮存液  溶剂，贮存液，稀释剂和储存
转铁蛋白50mg/ml  
胰岛素5mg/ml  
亚硒酸钠300μM  
黄体酮（20μM）  
腐胺（100μM）  
PEST（P104U/ml S104μg/ml）  
层粘连蛋白（100μg/ml）  
纤维连接蛋白（250μg/ml ）  
碱性rhFGF, （10μg/ml）  

包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）

包被液的准备
多聚-L-鸟氨酸，15μg/ml
把75ml多聚-L-鸟氨酸和425ml 1×PBS混合。贮存在4℃。
纤维结合蛋白，1μg/ml
把0.5ml纤维结合蛋白和500ml 1×PBS混合。

包被过程：
1．加入多聚-L-鸟氨酸，至少2－3小时（过夜也行）
2．吸出多聚-L-鸟氨酸
3．加入纤维结合蛋白，大约1－2小时
4．吸出纤维结合蛋白，放置30分钟晾干
5．贮存在4℃
24孔板用200μl，6孔板用500μl。震荡培养板确保溶液能够覆盖盖玻片或培养孔。有时需要剧烈震荡培养板。

体外分化方法

第1步：ES培养基
在LIF（ESGRO）存在的条件下维持细胞培养

第2步：EB培养基
使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
1．分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）
2．纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15ml管中离心3分钟。
3．用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液
4．一个15cm的细菌培养皿接种4～5×106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。
5．2天后更换培养基
将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
6．用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的分界。

第3步--ITSFn培养基
在最少量培养基中选择神经前体细胞
1．在胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基
2．并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3．保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。
观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。步骤的转换应该在神经前体细胞出现第一个清晰的标志几天以后，通常是在第3步的第6到第10天。

第4步－N3培养基＋bFGF
通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF的培养基中进行扩增。
1.PBS洗涤，加入2ml 1×胰酶（1个15cm的培养皿所需胰酶的量根据前文表中的体积）（10×胰酶EDTA用PBS稀释）
2．37℃孵育5分钟
3．用4mlEB培养基终止胰酶活性，将细胞转入锥形管中放置3～5分钟移出细胞团，将上清移入一新的离心管离心。
4．将细胞重悬于含有bFGF的N3培养基。
5．将细胞接种在包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片上（最好将盖玻片放于24孔培养板或6孔培养板，6孔培养板中每孔放置5个盖玻片如果是塑料的放置4个，以使最大可能的获得样品数量）。24孔板接种3.5×105/孔或6孔板1.7×106/孔。
6．2天后更换培养基

第5步－N3培养基
通过撤除bFGF使神经前体细胞分化
1．细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的N3培养基
2．根据需要换液（大约每隔一天）
3．分化10～15天后固定细胞
移除培养基
PBS洗涤
加入4%福尔马林
室温放置30分钟
PBS洗涤2次
储存于PBS。长期储存使用含0.01％叠氮化纳的PBS
移植细胞的准备
细胞在胚状体形成4天以后被移植（相应于体外分化过程中的第2步末细胞被转种到组织培养板）。正如在前文体外分化中所描述的在移植之前4天开始形成胚状体。通常再需要一天时间以便将胚状体移植入一10cm的培养皿。

移植
1．将胚状体转移至一15ml 圆锥形管中放置3～5分钟使胚状体沉降下来。
细胞被离心3分钟会更好。放置使之沉降将会去除更多的单个细胞（包括死细胞）而这些细胞可以被离心下来。
2．去除上清将胚状体重悬于无钙镁离子的1×PBS中
3．离心3分钟
4．去除上清加入1×胰酶（10cm的培养皿加1ml）
5．37℃水浴5分钟
6．加入5mlEB培养基小心吹打约10次
小心处理细胞很重要，进行细胞传代分散细胞时不可剧烈吹打。
7．离心2分钟
8．吸出上清将细胞重悬于500μl EB培养基
9．用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次
10．离心2次
11．吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基

烟酸己可碱标记ES细胞进行移植
1．准备一10μg/ml的烟酸已可碱染液（双苯酰亚胺，在冷冻室118）
2．加入1mg（你能称到的最小量）到5ml EB培养基（制成200μg/ml）
3．将溶液稀释成10μg/ml （100μl 200μg/ml 溶液和1.9ml EB培养基）
4．如前所述将细胞重悬于2ml烟酸已可碱染液而不是EB培养基中制备ES细胞悬液，
5．将悬液置于室温（或冰上）30分钟
6．离心2分钟
7．吸出上清将细胞重悬于2ml EB培养基
8．重复一次
9．离心2分钟
10．吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基并置于冰上。