产物条带很淡
转载请注明来自丁香园
反应成分问题：
| 可能的原因 | 解决办法 |
| 加样误差 | 重新进行PCR实验，确保没有加样误差 |
| 引物降解 | 重新订购引物 |
| 引物设计的不好 | 避免倾向形成发夹环或二聚体的引物 |
| 引物浓度过低 | 增加引物浓度，引物浓度可在0.1-0.5uM范围内按0.1的变化量变化 |
| 引物浓度不平衡 | 确保引物浓度相等 |
| 模板浓度过低 | 1. 通过电泳检查模板浓度 2. 增加模板浓度 |
| 模板量过多，过量的模板可结合所有的引物从而抑制反应 | 减少模板的量 |
| 聚合酶的量过少 | 按0.2U的变化量增加聚合酶的浓度 |
| 使用的聚合酶不合适 | 试用不同的聚合酶 |
| Mg离子浓度太低，抑制酶的活性 | 增加Mg离子浓度以降低退火的严谨性，Mg离子浓度可在1.5-4mM范围内按0.2-0.3的变化量变化 |
| dNTP浓度过低 | 增加dNTP，dNTP的正常浓度范围是20-200uM |
| 缓冲液(KCl)的浓度不合适 | 调节缓冲液(KCl)的浓度(产物<1000bp时提高浓度；产物>1000bp时降低浓度) |
反应条件问题：
| 可能的原因 | 解决办法 |
| 预变性不足 | 增加预变性的温度或时间 |
| 变性温度过高或过低 | 按1℃的变化量调节温度 |
| 变性时间太长或太短 | 按5秒的变化量调节温度 |
| 退火温度过高 | 1. 使用可靠的方法重新计算引物的Tm值 2. 按2℃的变化量降低退火温度，退火温度起点设在比两引物的最低Tm值低5℃ |
| 退火时间太短 | 按15s的间隔增加退火时间 |
| 延伸温度过高 | 按2℃的变化量降低延伸温度 |
| 延伸时间不足，特别是扩增长片段时 | 每扩增1kb的产物延伸时间为1-2min |
| 最后的延伸时间不足 | 增加最后的延伸时间 |
| 循环数不够 | 按3-5个循环的变化量增加循环数 |
| 矿物油质量问题 | 使用高质量、无核酸酶的轻质矿物油。不要使用高压灭菌过的矿物油 |
策略：
1. 将PCR产物稀释10-100倍后进行第二次扩增。
2. 将PCR产物稀释10-100倍后，使用Nested PCR扩增提高灵敏度。
| 以下网友留言只代表网友个人观点，不代表网站观点 | |||
Copyright 2000-2025 DXY.CN All Rights Reserved