dxy

有了图象分析软件，该怎么应用它来分析工作中的图片呢？这就涉及到图片分析的策略。这并没有一个权威的或者是已经有定论的方法。因此我在这里只能讲讲我自己作过的一些显微镜图片分析处理的方法。从我自己的体会来说，几乎每一项分析其策略都不同。我也不敢说自己的作法就是正确的。也没有多少文献可供参考。比如免疫组化染色图片的图象分析方法，查过一些文献，提到图片的数字分析处理时往往就几句话。有许多还是用图象分析仪测量的。我怀疑他们自己也没弄明白具体的分析策略是什么。

有人是这样作的：
使用正圆形AOI工具，在一张免疫组化图片上随机选取五个位置，分别测量这五个位置上这个正圆形区域的平均光密度，得到一个平均光密度值与标准差。
我认为这样作是错误的。因为这个平均光密度值的真值就是这张图片整个的平均光密度值。因此只要选一个矩形AOI，大小就是这张图片的尺寸，其平均光密度值就是刚才那个平均值的真值，没有标准差。

要作好免疫组化图片的数字分析，从拍摄显微镜照片时开始就要考虑操作细节了。作切片时要保证各个切片条件的一致就不说了，在使用数码相机拍摄切片照片时得注意什么呢？
1.显微镜的亮度要前后保持一致。这包括电源的电压要稳定，最好给显微镜加稳压电源，光源亮度调节在拍摄一组照片的过程中不能动，聚光镜也不能调。
2.数码相机不能用自动调节设置，全部用手动设置。包括曝光时间、变焦、光圈。还有一个很多人都想不到的地方：自动白平衡功能要关掉。前面的照片中有几张看上去背景是浅蓝色的，这就是数码相机的自动白平衡功能在起作用。因为整个画面都是黄色的染色，相机就会认为画面色温偏低，要进行一下较正，给加点蓝色吧。浅蓝色背景其光密度与浅黄色的阳性区域差不多，这样就给准确测量光密度带来了更大的误差。
3.拍摄荧光照片时自动曝光所带来的影响更大。前面有一张荧光照片，是从本论坛里找出的。这张照片曝光过度了，结果是最亮的几个细胞呈现出了黄色，而不是它们本身的红色或绿色。另外在细胞周围出现了光晕，给数字处理时的选色操作带来了困难。在选取AOI时不易选中准确的细胞界线。
4.在拍摄荧光照片时阳性细胞的光强度很大，阴性细胞光强度很弱。如果都用自己曝光拍摄，相机自己调节曝光时间，结果使者在照片上呈现出相同的光强度，这还怎么分析呀?
5.在拍摄双染色荧光切片时，如果要分析两种荧光各自的光强度，还在用单色CCD分别加各个染料的滤光片分别拍摄其单色照片分别分析比较准确。用彩色相机拍摄时问题会出在同一个位置两种荧光都有的地方，在彩色照片上这里会呈现出第三种颜色，数字照片的格式似乎很难分清这两种荧光在这里各占多少比例。

也许还是举个例子来讨论一下分析策略吧。

从直观来看这些切片图象，处理后切片整体感觉其“黄色”越来越浓。正常组织也有一点黄色的地方，而阴性对照组织则一点黄色的地方也没有。
分别测量一下各个照片整体的平均光密度（density mean）。
阴性 正常 一天 三天 五天
191 170 175 163 155
看上去用density（mean）测量其平均密度就行，各个片子之间有差异。可是把各组切片都这么测量一下，问题就来了，别忘了每组有十来张切片，其光密度值各有不同，因此进行了统计学处理后发现，除阴性组以外，其他各组之间并无显著性差异。看来简单地测量整张图片的density mean是不行的。

下一个招是测量图片中黄色区域的累积光密度（IOD）
阴性组几乎没有黄色区域，IOD很小。正常组也有黄色区域，与一天组、三天组之间，IOD没有显著性差异。五天组的实在是太“黄”了，其累积光密度与其他组有显著差异了。

其实图片中细胞间隙的背景也是有一定光密度的，测量一下，它的密度值与阳性区域差得还真不太大，这个密度值应该被扣去。

再加一招，计算每张图片中的：
阳性区域光密度值-（阳性区域中阴性部分光密度值）=阳性区域IOD-（阴性区域density mean） X （阳性区域Area）
式中阳性区域IOD是照片统计数据中IOD的SUM值。阴性区域 Density mean是阴性区域density （mean）的平均值。阳性区域Area是Area的SUM值。这回各组之间的差异就表现出来了。

不过这个策略是否正确，我也不敢较真。这些照片的背景是浅蓝色的，说明照片拍得还不够理想。这种扣背景的作法是否合适呢？

这个主题实际上太复杂了，太多了。写不完的。真希望大家学会了用IPP后把自己工作中的作法也加进来交流交流。我只能到此暂停一下。以后再慢慢增加。


编辑：bluelove