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    网友[biosepq]：
    我使用的是Agilent Zorbax C8柱（4.6×150mm），想在1100上进行一个蛋白的分析。样品是自己纯化的，SDS-PAGE纯度为90%以上，总蛋白浓度1mg/ml。

    流动相为：0.1% TFA in water　　0.1% TFA in ACN
    梯度：5～95%B，50min；100% B 10min

    进了两次样，第一次50vl，第二次100vl。然后进空白样（water），发现基线不稳，平衡柱子后，重复作上述线性梯度，依然有大量杂峰。用100% ACN洗柱 1hr，基线可以走得很平；5% B平衡，也可以走平。但重复走梯度，仍然基线在50～90%处有大量杂峰。请问，这是什么缘故？到底是什么东西一直出峰，是不是有蛋白沉淀在柱头了呢？

    网友[HPLC专家]回答：
    你用100% ACN洗柱 1hr，基线可以走得很平；5% B平衡，也可以走平，这是因为你不是走梯度，不存在柱平衡问题。走梯度，基线自然相对不稳。请你把走梯度测样品的色谱图附上给我，一看究竟，作对比。

    我对你的色谱图经过分析得出的结论是：你所面临的疑问和困难是因为你设计的梯度有问题。色谱柱有污染。要书面解释一下难解释，但问题的关键我已找到，你把蛋白的性质和HPLC的条件结合起来思考，相信你能明白其中的奥妙。

    另外，不知你的样品溶剂是否为纯水？你所获取的样品来源和纯化方法是什么？蛋白样品一般都较复杂，且成分纯度不高。所以在设计色谱条件时，要格外小心。

    网友[剡]回答：
    这种情况在前一段时间我也碰到过，花了一个来月才解决。

    有这样几种情况：
    1、水，应采用超纯水，不过超纯水有很多类型，基本、生物、仪器及ICP-MS几个等级，在低波长至少是仪器级的，同时注意瓶子的质量。不过，即使是最好的水，在低波长也有峰出现，只是很少，峰也小。水应采用新鲜的，最好加上高锰酸钾重新蒸馏以去除有机物（一般超纯水机只对电导指标很高，但是有机物指标不怎么样）。

    2、乙腈，应采用进口Merck的色谱纯，其他进口在低波长可能也不够要求，需要注意的是，开瓶后的试剂紫外吸收会增大，长时间放置不好，应用新鲜的，也要注意瓶子的问题。

    3、进样针，如果不进样走基线是好的，则进样针需清洗，这样针的干扰重复性很差。

    4、柱子问题，没洗干净，上面的问题好象不是这方面的。

    5、TFA，一般含量在0.1%，而且大多数采用进口，含量低，不会是主要原因。

    6、程序，在梯度变化时，如果变化速率过快，会出现鬼峰，位置比较固定，这时需改变变化速率。

    7、建议用拆除色谱柱后，冲洗整个仪器流路系统，特别是混合器中的杂质也可能导致这种情况。

    同时可以到中国色谱网论坛中查看类似贴子的讨论（http://www.sepu.net/dvbbs/dispbbs.asp?boardid=13&id=46024）。


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