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1 介绍
关于动物细胞规模化培养的介绍网上有很多，比如 http://www.istis.sh.cn/list/list.asp?id=1253 ，是我们国家近年来扶持的关键技术之一。该技术主要应用于复杂、分子量巨大的蛋白表达及基因治疗或疫苗的病毒生产，和其他工艺过程相比优势明显，但学科交叉大，涉及细胞生物学，生化工程，机电工程（这个话题比较宽泛，涉及整个制造业环境）等多学科知识，难点很多。 具体到实验室规模，难度主要体现在：
1）高效表达载体的构建，这个也没什么好说。
2）cell line的筛选是一个很繁重的工作（对于稳定株筛选而言）。
3）无血清悬浮培养驯化，主要也就是无血清培养基的优化也是一个工作量巨大的工程，由于商业上的原因该方面的成果基本上很少共享。目前各公司采取的策略基本上有两种：自主研发和从商业培养基提供商（比如SFAC，GBiCO）获得。但最终都会倾向于自己研发为主。
4）高密度培养和流加工艺，目前也主要有两种用于工业化生产：批次补料（fed-batch cultivation process）和灌注培养（perfusin cultivation process）。两种工艺各有优缺点，但是如果要做上上万升的规模，fed-batch cultivation process则更易于放大。
5）不管是从细胞生物学的角度还是培养工艺的角度，防止细胞过早凋亡，产率下降都是一个难题。这有赖于细胞株在分子水平上的进一步改造（比如重组入各种抗凋亡基因）和培养后期加入各种抗凋亡的营养物质。

2 进展
随着整个产业的发展，该项技术的更新可以说是非常惊人的，20年前细胞培养的水平还在最高10⁶ cells/mL上下徘徊（antibody表达量不过区区30－50mg/L），而20年后的今天，文献报道已经达到了5×10⁷ cell/mL（antibody表达量也已经达到了5g/L的水平，在未来3－5年很可能达到10－20g/L（according to materials from Amgen Inc.））。 http://www.ibclifesciences.com/BPI/US/ 从最近一期国际生物过程工艺会议上可以看见。

另外，随着人类基因组计划的完成，在后基因组时代各个研究机构、生物制药公司将要对成千上万的蛋白进行功能研究和筛选，但这么多蛋白又不可能在短时间内完全由单个独立的单位来完成，因此也孕育了一个巨大的为生物制药公司和研究单位提供这方面服务的市场。每个蛋白都需要mg-g级水平，同时又要具有与天然蛋白几乎完全一样的功能和结构，所以谁能够在短时间内具有更大的生产能力无疑就是这个市场的胜利者。在这个方面最近几年一直有更新的技术出现。

3 相关资料
http://www.accelacast.com/programs/ibc_technologies/

Bioprocess international conference&exhibition ， 2005 的演讲资料。
1 H. Michael Koplove， Ph.D.， Vice President， Wyeth BioPharma/Vaccine Technology and Engineering
Bulding， buying， remodeling， and selling biopharmceutical plants

2 Duncan Low， Ph.D.， Amgen Inc.， Process Development， Scientific Director
Current practices and future directions in bioprocess

4 技术分析

Why mammalian cells?

"Some advantages of the use of mammalian cells as hosts for the production of heterologous proteins are：
（a） proteins are readily synthesized and secreted directly into medium， which makes purification and recovery simple and straightforward;
（b） proteins are folded， and disulphide bond formation is established efficiently. These processes take place in a manner very much like that of natural proteins. Both N-linked and O-linked glycosylation occur at normal positions， and other post-translation modifications， such as gamma-carboxylation， beta-hydroxylation， tyrosine sulphation， phosphorylation， and glycosylation are performed in mammalian cells. Moreover， multimeric proteins can be correctly assembled."
...Annals of Hematology1994;68 Suppl 3：S9-14

Some cases for large scale vaccine production

细胞培养制备流感疫苗主要使用Vero、MDCK、PER.C6三个细胞系。一般而言，Vero细胞系产量小，副作用低些，MDCK细胞系产量高，副作用大些。Solvay、GSK及凯龙都选择了MDCK细胞系，其中Solvay使用MDCK生产的流感疫苗已经在荷兰上市，商品名为Influvac TC，凯龙的流感疫苗在欧洲已经进入了Ⅲ期临床研究，而使用Vero细胞培养的流感疫苗遇到困难。Baxter公司的流感疫苗在进行Ⅰ/Ⅱ期临床研究时发现发热过高，已经于2004年暂停，在调整配方后，预计在本年底重新启动。巴斯德与Crucell公司合作开发的基于PER.C6系平台的流感疫苗也将于今年底进入临床研究。
from http://www.biotech.org.cn/news/news/show.php?id=37481

Transient expression in large scale

各制药公司为了在短时间内获得数种mg－g级的蛋白进行功能研究或者药物筛选（以满足大型动物实验、下游工艺的初步开发、稳定性测试等等），而利润点的趋同也使得竞争尤为残酷－－输掉的一方将失去之前投资的几乎所有研发成本，因此时间也就成为了竞争中最重要的一环。用常规的方法，即获得稳定的表达株，根据文献我们知道，从上游构建开始到最终结束，耗时基本上在4－6个月左右或更长，在这种情况下大规模的瞬时表达开始成为研究的热点。

transient expression对于大多数做基础研究的人来说并不陌生。对于转染方法而言主要有如下几种选择：

1) 脂质体传染： 我们知道用脂质体传染做大规模的生产几乎是不可能的。原因在于脂质体非常昂贵和大剂量下的细胞毒性。
2) 磷酸钙法传染：是一个比较传统和便宜的方法，在优化好各种参数后也可以得到相当高的转染效率。但它唯一也是致命的缺陷在于其过于复杂的转染步骤（过多的离心和换液）可能引入污染和需要更多的设备投入（大规模的情况下，工艺的简单变更也会引起成本的数倍增加）。目前可以查到的文献，利用改良的磷酸钙法传染和瞬时表达，最大的规模是100L（引入了抗生素）。
3）PEI及类似物传染： PEI是一种很廉价的化工原料，主要用于造纸、水处理等行业，1995年（或更早）Otmane Boussif等发现它具有传递DNA的功能同时具有相对很低的细胞毒性，并将这一发现发表在PNAS上。这一发现马上引起了从事gene therapy 的同行注意，PEI也成了nonviral gene delivery systems中十分重要的一员。紧接着几年，PEI也进入了转染试剂的行列，一个新的公司：Polyplus-transfection Inc.应运而生，同时Roche 在05年底（或06年初）推出了基于PEI转染的 FuGENE HD。基于PEI的转染实验有着其他转染方法不可比拟的优势：在保持高的转染效率的同时很小的细胞毒性，转染完毕不需要更换培养基（这一点非常适合大规模的悬浮细胞的转染），化学修饰或和其他试剂共同作用后对血清极大降低了敏感性（作为通用转染试剂必备条件）。

责任编辑：丁香福气兔