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    A1： 在做细胞的双荧光染色（分别是红光和绿光），然后在荧光显微镜下计数双阳性细胞，我想问一下，可否将黄光阳性细胞认为是双阳性细胞（因为在荧光显微镜下有黄光，且与红、绿光基本一致），这样做误差大吗？

    Q1：荧光是一种激发光,你给予一定范围的光能量刺激,原子核周围发生能级跳跃,产生荧光。给予350nm波长左右的光刺激，产生蓝光，480-500nm是绿光，535nm左右是黄光，550-560nm是棕黄色到红色，600nm左右是深红色，650nm是紫色。 
    简单地说，常规荧光显微镜提供广谱光源,涵盖从350nm-650nm的范围，所以应该是每一种荧光都被激发了。可是荧光显微镜还有一套吸收滤片，常规的三块，350nm（忘了名字），488nm（FITC），564nm（TRITC），因此切换到相应的滤片，如FITC，就只能看到绿色，其它荧光均被吸收。到目前为止，我还没有听说过任何公司生产535nm的滤片，你用红绿光，应该是红光看到红色，绿光看到绿色，绝对不会出现黄色。有种可能是早期的显微镜技术不高，容易出现漏色现象，就是其它波长的荧光吸收不佳。共聚焦显微镜的高级处之一是，它的激发光是单波长激光，要488nm就只有488nm。基本排除其它杂光干扰,背景清楚。
    回到你的课题来，简单的办法，用DAPI染色细胞核计数100个细胞（蓝光，350nm），每一个细胞，先用488nm观察绿光，然后不动切片，切换滤片到红光，观察红色，同时有两色才是阳性，更简单的方法，用10x镜头拍数码照片，不动切片，分别拍蓝、绿、红三色，用PHOTOSHOP将红绿两张叠加，橙黄色的细胞就是阳性，DAPI蓝色提供细胞总数。

    A2：是否能选用一种激发波长（对两种荧光染料均可，因有交叉波长的），若是双染阳性则出现两色不同的着色?

    Q2：普通荧光显微镜肯定不行，只能在同一视野分别拍下红光和绿光、再重叠。

编辑：qingqingruochen