检测穿过的细胞数有两种方法：
2．4．1 直接计数法
2．4．1．1 “贴壁”细胞计数
这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。如下图：
Fig7
通过给细胞染色，可在镜下计数细胞：
① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞。
② 染色：常用的染色方法有结晶紫染色、台肦蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等。
个人推荐采用0.1%结晶紫染色，这种方法有如下优势：（1） 不需要固定细胞，直接染色即可。（2） 配制简单方便。（3） 染色后可以用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm 测其OD值，间接反映细胞数。个人认为这是结晶紫染色最大的优势所在。因为，虽然经过准确的细胞计数，往往穿过膜的细胞数仍难以准确控制，可能某一批实验穿过的细胞会特别多，以致细胞成堆，这种情况下就难以计数了，这种情况下就可以用醋酸脱色后用酶标仪检测。使用结晶紫染色要注意，染色前要将膜风干，否则可能会染不上。
③ 细胞计数：我们使用的是Leica DC 300F正置显微镜进行观察和拍照，把Transwell小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。也有不少人用手术刀将膜切下后染色，再贴在玻片上，滴二甲苯，再盖上盖玻片，就可以长期保存，但是这样做小室就成了一次性的了，未免有点浪费。
取若干个视野计数细胞个数。论坛里一般采用3－5个视野，也有人用10个，都是随机选取，个人认为这样选择的视野带有很大的偶然性，也会掺进人为影响，特别是计数视野较少的时候。我选取16个视野，不是随机选择，而是有固定的位置。我们使用的显微镜所看到的视野的直径刚好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直径的1/4。
Fig8
如图，蓝色部分表示膜的大小，白色圆形表示视野的大小，绿色方形则表示拍照时所能拍下的视野的中心部分。这样，每个小室都拍摄如下图的16个视野进行计数，这样得到结果是比较客观和准确的。
Fig9
2．4．2 间接计数法
间接计数法主要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法，与常用的MTT实验是同样的原理。
2．4．2．1 MTT法
① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞
② 24孔板中加入500µl含0.5mg/ml MTT的完全培养基，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃ 4h后取出。
③ 24孔板中加入500µl DMSO，将小室置于其中，使膜浸没在DMSO中，振荡10min，使甲臜充分溶解。取出小室，24孔板于酶标仪上测OD值。
2．4．2．2 荧光试剂检测
这类方法一般是与Transwell小室一起出售的，其原理与MTT法类似，是用一种荧光染料染细胞，再将细胞裂解，检测荧光值。Chemicon的ECM554即属于这类。
2．4．2．3 结晶紫检测
上文已说过，这里不再赘述，原理与MTT法也是类似的。但结晶紫染色还有个优点，就是染色和脱色的过程并不影响膜上细胞，在脱色后还可重新染色。
2．4．2．4 “非贴壁”细胞计数
由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系，有时细胞在穿过膜后不能附着在膜上，而是掉进下室。如下图：
Fig10
第三节 Transwell的其他应用的实验步骤
1．Transwell肿瘤细胞迁移实验
过程与Transwell侵袭实验基本一致，不同的只是不需要铺Matrigel。个人认为，由于没有基质胶的阻挡，细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快，所以细胞量要更大。我做侵袭实验的细胞密度是1×105，而迁移实验的密度是1×106。另外，下层培养液的FBS浓度也可适当下调，我做侵袭实验的浓度是5%，迁移实验的浓度是2.5%。
2．cathywxy战友的Transwell上皮细胞培养步骤
做了一段时间的原代细胞培养，把经验拿出来跟大家分享一下吧，请大家共同探讨：
（1） 将雄性wistar大鼠麻醉，开胸，将气管取出，置于4℃含0.1%胰蛋白酶XIV （Sigma），100 U/ml青霉素和100ug/ml链霉素（Gibco-BRL）、无Ca 2＋、Mg 2＋，无血清的MEM。
（2） 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁，将所得溶液离心后得到游离细胞。
（3） 离心后立即用新鲜的上述MEM溶液（含10%胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5%胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素的LHC-8 medium （Biofluids）冲洗一次。
（4） 冲洗过后，将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力，若存活率大于90%，则将细胞以10 6/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12 mm SNAPWELL， Costar），以37°C 5%CO2-95% 空气含5% 胎牛血清（Gibco-BRL） and 100 U/ml 青霉素and 100ug/ml 链霉素的LHC-8 medium孵育6～10天。
（5） 孵育后，经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间，即可用于电生理试验。
显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片
链接： http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/3750799_1.html
3. metastasis战友的Transwell B16细胞的体外迁移实验
我以前用 costar的Transwell做过B16细胞的体外迁移实验，具体是这么做的：首先把Transwell倒置，在Transwell的PVPF膜（0.8 um）的下表面涂一层fibronectin（10 ug/ml，50ul），37度2小时，PBS洗一遍后，放入预先每孔加有600ul的培养基（含10%血清）的24孔板内，后在Transwell的内室加入细胞（100ul，用含0.1%血清的培养基稀释好自己所需密度），放入培养箱，12-18小时后，取出Transwell，用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面的细胞，另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟，结晶紫染色20分钟，用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数。
链接： http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2681611&sty=3&keywords=Transwell
4．mci战友的内皮细胞HMEC-1迁移实验
1%明胶处理的transwell经无血清的MCDB131培液于培养箱中平衡1小时后，上室加入100µl用serum-free MCDB131稀释的5×104/孔的HMEC及不同浓度的药物，下室加入0.6ml serum-free的MCDB131培液及20%FCS刺激迁移，同时设置相应阴性及阳性对照，置于CO2培养箱中作用8小时，然后弃去孔中培液，用90%酒精常温固定30分钟，0.1%结晶紫常温染色10分钟，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜（Olympus，DP50， Japan）。下观察并拍照，最后用10%乙酸100µl/孔抽提10分钟，于600nm处测定OD值。抑制率计算公式为：抑制率（%）=【（OD值给药组-OD值无刺激阴性对照）/（OD值不加药阳性对照- OD值无刺激阴性对照）】×100%。
链接： http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=850667&sty=3&keywords=Transwell
作者: lwjssry
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