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第四部分 修饰后DNA用于PCR


这一步也没有悬念。我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：

1. 引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度，我曾设计过几对引物，并且试验了一下，但以失败告终。如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多，自己设计引物没有问题。如果不是这样，还是参考文献更好些。首先查阅SCI分值高的文献，然后是著名实验室的文献，如果国内有做的，更好了，可以直接联系咨询。查到序列后，一定要和Genbank中的序列进行比对，防止有印刷错误造成的个别碱基的差别。然后再到google上搜一下，看用的人多否，体系条件是否一样。用的人多、体系条件一样，表明可重复性比较强。我也是按此行事，算比较顺利。

2. Taq酶问题：有文献用高保真的金牌Taq（Platinum），但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适，一般的热启动酶是可以的。我开始使用的是Takara的LA Taq，很好用，配有10x含mg++的LA缓冲液。有时候用没了，暂时以Takara 的普通Taq酶也可以。如何选择，可以根据自己的情况。初作者还是用好一点的酶。

3. PCR的条件：变性一般都选择95℃，3min。其余我感觉还是根据文献，退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试。一般和文献报道差别不大。只是扩增片断特异性的问题。建议根据文献。

4. 做PCR的EP管最好选择进口的，壁薄且厚度均匀，这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液，使体系真正在所设定的温度下运行。

5. PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了，最好一直用此仪器继续。不同的仪器“脾气”也不一样，但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好，留有空隙，我认为会影响温度的传递。

这一部分有些啰嗦，只是个人一些不成熟经验。有疑问处，请大家指出，交流。今天先到这里，现写一些内容，比较费劲，总是不能一挥而就。望见谅。歇息一会准备写最后蓝白斑筛选克隆这一部分。

第五部分 PCR产物的凝胶回收


这一步比较简单，可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒，国产的就很好、价格也合理，比如TIANGEN的产品（用过）。把切下来的胶按说明书操作即可。

几个细节：
1. PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，要使用新配的电泳液。凝胶浓度1%-2%均可。

2. 凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置，切取目的片断所在位置的凝胶，尽量小，保证特异性。

3. 紫外照射时间不能过长，否则对DNA有损伤。

4. 回收后的DNA如不马上用就储存于-20℃，在数月内是很稳定的。


第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选


1. 连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）
15ul体系
T-easy 1ul
Ligase 1ul
2xbuffer 7.5ul
DNA 5.5ul
4℃，过夜。  

2. 连接产物的转化
1）-70度冰箱内取出感受态细菌，融化后置于冰上；
2）连接产物15ul 全部加入，至于冰上30分钟；
3）42℃， 90秒钟；
4）冰上2分钟；
5）800ul LB培养基；
6）280rpm，37℃，摇床45分钟（将管放水平了摇，保证菌液摇匀）；
7）8000rpm，1分钟；在超净台内去上清，留100-150ul；
8）涂板：37℃孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）
先涂：X-gar 35ul，IPTG 25ul ，后涂：混悬液 。过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点，取白色斑点，尤其是蓝色斑点周围的白色斑点，此处自联率较低。

3. 取白斑，划种于新板上
新板：先涂：X-gar 35ul，IPTG 25ul ，然后于板底划出分区，进行标记。根据需要，一般一板作50个克隆没有问题。
针头挑白斑划2道于板上相应区域内。37℃，孵箱过夜。

4. 联系测序公司送测序。一般一个克隆在35-45元。

这一部分的细节：
1. 涂板要均匀，保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；

2. 不要让蓝白斑长得太满，否则选取克隆时容易一下挑2个。

以上是我实验的全部过程，终于写完了和大家分享，希望对大家有帮助。如有疑问，敬请提出，以便交流。并请不吝斧正。

编辑：blue