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原位杂交

步骤
1、  玻片的处理；
2、  细胞培养；
3、  培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为，4%多聚甲醛/0.1M PBS（PH7.2-7.4），含有1/1000DEPC，室温固定20-30分钟。蒸馏水或0.1M PBS（DEPC）5’*2充分洗涤，干燥后-20℃冰冻，可保存2周以上。
4、  Triton-100（3%） 6’，0.1M TBS 5’*3次；
5、  暴露mRNA核酸片断：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，(1ml 3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5-120秒钟（90秒）。有时也可以不消化。0.5M TBS洗5’*3次，蒸馏水洗1次。
6、  预杂交：湿盒的准备---干的杂交盒底部加20%甘油20ml，以保持湿度，按每张切片20ul加预杂交液，恒温箱37-40℃，2-4h，吸取多余液体，不洗。
7、  杂交：用杂交液稀释地高辛标记的寡核苷酸探针，浓度一般0.5-2ug/ml。按每张切片加20ul杂交液，将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上，恒温箱37-41.8℃，杂交过夜（36h）。
8、  杂交后洗涤揭掉盖玻片，30-37℃左右水温的2×SSC洗5’*2次，0.5×SSC洗涤15分钟×1次；0.2×SSC洗涤15分钟×1次。必要时可重复0.2×SSC洗涤1次。
9、  滴加封闭液：37℃ 30分钟，甩去多余液体，不洗；
10、  滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃ 60分钟或室温120分钟，0.5M TBS洗5’*4次。
勿用其他缓冲液和蒸馏水洗涤
11、滴加SABC-AP：37℃ 30分钟，0.5M TBS洗5’*4次。
勿用其他缓冲液和蒸馏水洗涤
12、BCIP/NBT显色：BCIP/NBT（×20）按1：20的比例用0.01M TBS（PH9.5）稀释，混匀。显色液加至标本上，一般30-37℃显色20-30分钟，若无背景出现则可继续显色，充分水洗。
13、必要时核固红复染30-60秒，水洗。
14、水溶性封片剂封片，摄像。



准备工作

A：缓冲液的配制：
3%柠檬酸：100ml蒸馏水中加柠檬酸（C6H8O7.H2O） 3g，PH2.0左右
2×SSC---1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠（C6H5O7Na3.2H2O，分子量294）8.8g
0.5×SSC---300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可（1：3）
0.2×SSC---270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可（1：9）
20%甘油---20ml甘油加80ml蒸馏水即可
0.5M TBS---1000ml蒸馏水加氯化钠30g，TRIS 1.2g 纯乙酸0.4-0.5ml,PH7.2-7.6
0.01M TBS(PH9.0-9.5)配法：1000ml蒸馏水中加NaCL9g, Tris 1.2g

B：操作程序：
注意：最重要是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。

C：免疫组化缓冲液的配制：
1  0.2M PB
①0.2M NaH2PO4：NaH2PO4.2H2O 31.2g（或NaH2PO4.H2O 27.6g） 加重蒸水1000ml②0.2M Na2HPO4：Na2HPO4.12H2O71.632g（或NaH2PO4.7H2O 53.6g或NaH2PO4.2H2O 35.6g） 加重蒸水1000ml
③0.2M PB：19ml①+81ml②混合即可，pH值约为7.4-7.5
2  0.01M PBS
NaCl8.5-9g, 0.2M PB 50ml,加重蒸水1000ml混匀即可
3  0.5M TBS
①0.5M Tris-HCl缓冲液:
Tris(三羟甲基氨基甲烷) 60.57g
1N HCl 约420ml
重蒸水 至1000ml
先用少量重蒸水300-500ml溶解Tris(三羟甲基氨基甲烷)，加入HCl后，用1N NaOH 或HCl将pH调至7.6，最后加重蒸水至1000ml，此液为储备液，于4℃冰箱中保存，免疫细胞化学中常用的Tris-HCl缓冲液浓度为0.05M，用时取储备液稀释10倍即可。
主要用于配制Tris缓冲生理盐水（TBS）、DAB显色液等
  4  Tris缓冲生理盐水（TBS）
0.5M Tris-HCl缓冲液 100ml
NaCl 3.5-9g(0.15M)
重蒸水 至1000ml
先以重蒸水少许溶解NaCl，再加Tris-HCl缓冲液，最后加重蒸水1000ml，最终浓度为0.05M。

编辑：sdimmuno