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胚胎干细胞显微注射是制作基因敲除小鼠的一个最常用的方法。主要过程是将携带目的基因的胚胎干细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠。所得嵌合体小鼠的组织，将同时含有来源于囊胚的细胞和胚胎干细胞。嵌合体小鼠必须和野生型小鼠配种以决定遗传改变的生殖系能否传递，这样可能获得转基因或打靶基因（来源于胚胎干细胞）稳定的生殖系传递的小鼠。一般情况下，大约能获得50%继承了目的基因的后代。

用胚胎干细胞注射与DNA显微注射类似，首先要对囊胚的供体鼠进行超排和交配以获得大量的胚胎，然后将注射了胚胎干细胞的囊胚移植到代孕母鼠输卵管（或子宫）使胚胎继续发育。