dxy

 一、 ChIP Sequencing（ChIP-Seq）常见问题及解答

1. ChIP-Seq服务中免疫沉淀（ChIP）部分是否可以在BGI完成？

视免疫沉淀类型而定，目前BGI已经购买的标准抗体有：H3K4Me3，H3K4Me2，H3K9Me2，H3K9Me3，H3K27me3，H3K27Me2，且前期免疫沉淀技术的研发是基于人的细胞样品，如果您的实验需求完全符合上述条件，BGI可以进行免疫沉淀实验，只需要您提供足够的细胞样品。如果您的实验涉及其他抗体其他非人物种的非细胞样品，我们建议免疫沉淀自行完成，若实在需要，BGI可尝试进行研发，研发细节另行协商。
 

2. ChIP-Seq服务中ChIP实验为什么有2种细胞送样要求？

BGI已经建立的ChIP实验分为2种：X-ChIP和 N-ChIP。X-ChIP适合于大部分的DNA-protein相互作用研究。 N-ChIP更针对于组蛋白修饰的研究，不太适合于结合力较弱的DNA-protein相互作用研究。因为这两种ChIP实验对细胞有不同的前期处理要求，因此有2种不同的送样要求。原则上由合作伙伴自行根据实验需要，选择其中一种方法。如果需要我们的建议，则如上所述。
 

3. ChIP-Seq服务中建库需要做PCR吗？对后续的实验结果是否会有影响？

由于ChIP下来的DNA产物非常微量，在建库过程中为保证可以得到足够的DNA量用于上机测序，我们会进行低cycle的扩增（15cycle以下），尽量将因PCR扩增引起的bias 降到最低。另外，在测序结果出来后，针对reads的比对结果，通过信息分析手段可以去除duplication的影响。如果您送的样品在免疫沉淀富集后有做过PCR扩增，那么这一步的PCR对结果的duplication影响非常严重。
 

4. ChIP-seq需要测多少数据量足够？

目前我们提供三种不同的数据量可供选择：10M/20M/50Mreads（50SE）

数据量的选择从理论上来说，决定于目的蛋白在全基因组上结合位点所占的比例。根据已有的项目经验，我们建议一个样品至少不低于10M的reads数，这个数据量可以满足大部分项目的信息分析需求，但具体项目还需合作伙伴自行考虑决定。
 

5. 哪些因素会影响ChIP-Seq的结果？

抗体的质量与特异性、需要富集的目标区域在基因组上的比例、ChIP的实验操作、DNA片段长度范围等都会影响ChIP-Seq的结果。
 

6. DNA片段范围的跨度会对后续测序有影响吗？

有影响，定量准确性、测序质量与数据产量都可能受到影响，而且跨度越大，影响越大。通常我们要求打断后DNA电泳主带在100-500bp范围内，主峰介于200-300bp。目前在建库过程中允许的最长跨度为200bp。
 

二、 Bisulfite Sequencing（Bisulfite-seq）常见问题及解答

1. 怎样保证bisulfite对DNA处理的完全性？

目前我们建立了标准实验流程，确保bisulfite对DNA的处理达到生物信息分析要求。我们的标准实验流程是在对标准品DNA、H19等对多个基因位点的多次验证基础上建立起来的。为使项目更加完善，您可以在您的项目里要求加入control DNA 做平行对照。
 

2. Bisulfite -seq需要测多少的数据量足够？

根据已有的项目经验与信息分析需求，大部分物种我们推荐数据量为基因组大小的20-30X。但对于基因组特别小的物种，比如微生物，则不按照此公式计算，一般建议做2G一个样品。

另外，对于低甲基化率或甲基化率无法估计的物种，有可能存在其甲基化率低于Bisulfite -seq假阳性率的情况（参考家蚕案例）。如此，我们则需要采取家蚕的技术方案，即采用增加生物学重复个体的方法来追加数据量。
 

3. Bisulfite-Seq中如何定义支持甲基化的read？

Reads是否支持甲基化是针对某一个位点而言的，在这个位点上，若read1（正链）C与C比对上（即：甲基化的C，没有发生转化），且read2（负链）G与G也比对上，那么这个read在这个位点上就是支持甲基化的read，反之就是支持非甲基化的read。
 

4. 怎样判定位点的甲基化信息？

高分辨率的甲基化信息的优势在于给出甲基化水平的量化信息，我们通过被覆盖区域上测序得到的C和T的总数比例进行甲基化水平的判定。例如，在一个区域内，测序得到6个C，4个T，那么该区域的甲基化水平为6/（4+6）= 60%。
 

5. Bisulfite-Seq是否可以统计甲基化频率？

可以，但是并不包含在标准信息分析流程中。甲基化频率，就是指相隔多少个碱基（ATCG），会出现一个甲基化的C，模式生物拟蓝芥和人中都做过相关统计（Nature）。
 

6. Bisulfite-Seq项目启动需要考虑哪些因素？

需要考虑该物种是否为低甲基化率的物种、该物种的基因组完成情况如何（这会影响到数据的比对）以及基因组是否存在复杂因素：GC含量偏高、杂合度偏高、转座子、重复区域等。
 

三、 MeDIP Sequencing（MeDIP-seq）常见问题及解答

1. MeDIP-Seq的分辨率有多高，是否能精确到单个位点？

MeDIP-Seq是基于抗体富集的实验方法而进行的DNA甲基化分析。因此可以通过测序数据在基因组上的富集性分布而反映出相应区域的甲基化状态，但是由于无法确定富集下来的DNA片段中发生甲基化C碱基的确切位点，所以无法得到单个碱基的甲基化水平。
 

2. MeDIP-Seq的覆盖度与测序深度是多少？

根据我们对炎黄1号的数据分析结果，5-8G的MeDIP-seq数据大概能覆盖人类基因组的30％左右，平均测序深度不到10X。其实对MeDIP-seq而言，数据在基因组上呈富集性分布，平均测序深度并没有太大的参考意义。
 

3. MeDIP-Seq中每个样品需要多少数据量？

对于人类疾病类研究，由于样品数量较大，需要考虑到项目费用问题，数据量的选择可根据项目需求参考我们的MeDIP饱和度分析结果（人外周血样品， 8G数据，不同设定条件下的饱和曲线），如下图所示：

对于其他小样本量研究，我们建议选择 4G/样品，甚至更多。

4. MeDIP-Seq主要应用于哪些研究？

目前我们的MeDIP-Seq主要基于人类样品而研发，可以说是一个很好的疾病研究技术。但对于非哺乳动物物种，由于methylation pattern有较大差异，现有的信息分析流程可能并不一定适用。目前我们正在着手于新的信息分析流程开发，以尽快解决这个问题。

对于MeDIP-Seq做其他物种样本，跟据具体项目情况BGI可尝试研发，具体研发细节需另行与合作伙伴协商。