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一、 国内第一篇应用全外显子组测序技术研究单基因病文章

概述：2010年11月23日， "Brain”杂志在线发表了由深圳华大基因研究院、中南大学湘雅医院等单位合作研究的成果“利用全外显子组测序技术揭示小脑共济失调新的致病基因TGM6”。这是国内科学家应用全外显子组测序技术进行单基因病研究发表的第一篇文章，对国内单基因病研究具有重要的参考价值。

小脑共济失调是一种常染色体显性遗传的神经系统疾病，疾病临床常表现为运动失调。应用传统的定位克隆方法已经在人类基因组上定位了对应不同亚型的31个位点，并确定了其中19个亚型的致病基因。本研究发现了小脑共济失调家族SCA23亚型新的致病基因TGM6。该基因的发现，对今后阐明小脑共济失调发病机制、遗传诊断和新药研发具有重要的科学和应用价值。

方法：

样本选取：

同一家系中的4个患病个体的血液样本

外显子捕获与测序：

随机打断基因组DNA，在其两端添加接头，用NimbleGen 2.1M Human Exome Array 进行外显子区域捕获后，利用新一代高通量测序技术对样本进行测序。

结果：

该研究对患有小脑共济失调的同一家系4个患者进行了全外显子组测序（平均测序深度65.1×），在每个患者的外显子区域平均检测到约5800个潜在影响基因功能的变异，包括NS（非同义突变）、SS（剪切位点突变）和Indel（插入缺失突变），其中包含了大量的罕见变异。

筛选流程：（1）过滤掉同义突变等不影响基因功能的突变，只保留非同义突变、剪切位点突变、插入缺失等影响基因功能的突变；（2）过滤掉公共遗传突变数据库(dbSNP等)正常人携带的常见突变、已发表的正常对照个体的突变；（3）根据软件对突变进行功能预测，获得对功能有影响的候选基因和突变位点；（4）最后在所有患病个体的候选基因和突变位点集合中取交集。

研究者通过生物信息学分析，将候选致病基因突变锁定到TGM6基因第10外显子保守区域的一个错义突变（L517W），进一步验证发现在另一个患有该病的家系里TGM6基因存在另一个错义突变，从而证实该基因是小脑共济失调家族新的致病基因，属于SCA23亚型。验证策略如下：

1) Sanger测序检测该家系（CS）里其他患者和正常人，观察到基因突变和表型共分离。

2) Sanger测序检测84个其他家系先证者中TGM6基因的全部外显子，其中一个家系（LY）中发现该基因的另一个错义突变（D327G）。

3) Sanger测序检测500个正常人的TGM6基因，未发现前两步中候选致病基因中的功能突变。

图1 杂合错义突变、人类 TGM6 基因的基因组结构以及TGM6 的区域结构

A，B: Sanger 测序CS家系中TGM6 基因L517W 附近的3个密码子（A 野生型，B 突变型）; D，E: Sanger 测序LY家系中TGM6 基因 D327G 附近的3个密码子（D 野生型，E 突变型）; C，F: 通过在其他6种脊椎动物中比较发现，L517W和 D327G两个杂合错义突变处于TGM6极其保守区域；G: TGM6 的区域结构：L517W突变 （灰色） 位于转谷氨酰胺酶的 C 端区域，D327G突变（灰色）位于转谷氨酰胺酶的核心区域。

二、第一篇基于外显子测序的方法学文章

2009年8月16日，Nature杂志在线发表了12个人类外显子组测序的文章。

这是第一篇通过外显子测序发现单基因病致病基因的方法学文章。这篇文章比较了基于外显子测序研究单基因病的方法与传统研究单基因病方法的数据和结果，证实了借助外显子测序技术研究单基因疾病数据可靠、方法可行！

1) 测序的12个个体中的8个来自国际人类单体型图计划（HapMap），另外4个是无亲缘关系且同为弗里曼谢尔登综合症患者；
      2) 该症是由MYH3基因变异引起的一种罕见的常染色体显性遗传的单基因病；
      3) 通过分析发现，外显子测序方法鉴定的变异具有很高的准确性，并且通过多步筛选准确找到了该病的致病基因 MYH3；
      4) 该文章的发表为单基因遗传病研究提供了全新的方法。
 

三、外显子测序在单基因病研究上的首次应用

2009年11月13日，Nature Genetics 杂志在线发表了利用外显子测序技术揭示米勒综合症致病基因的文章。

这是首次将这这种方法成功用于发现一种未知病因的单基因遗传疾病的致病基因的报道。这篇文章为单基因疾病的研究开辟了一条新的道路，证实应用外显子测序技术可以寻找到单基因疾病的致病基因！

1) 研究人员选择了来自三个独立家系的四名米勒综合症（常染色体隐性遗传单基因病）患者，进行外显子测序；

2) 通过与公共SNP数据库和8个来自HapMap的个体外显子数据相比较，4个患者都同时含有2个先前未知的变异，这2个变异同时位于一个候选基因DHODH上，该基因编码一个嘧啶从头合成途径中的关键酶蛋白；

3) 进一步在其它3个米勒综合症的家系中进行验证，发现患者的DHODH基因上同样存在这个突变。