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内参

内参在生物学研究中非常常见。例如RT-PCR或western blot实验中常用表达量稳定的管家基因/蛋白作为评估不同样本之间目标基因或蛋白变化的参考。以western blot为例，如果加药处理前后GAPDH或tublin、actin等基本没有变化，而目标蛋白表达变化明显，则说明“加药”这一事件过程中目标蛋白的表达受到影响。内参的引入可以排除上样量不同或样本处理过程中的偏差导致的可能误差，同时也便于将差异进行更加准确的量化。在miRNA定量分析或芯片实验筛选之后的差异miRNA验证过程中常常采用qPCR的方法，类似地，miRNA定量分析采用相对定量，也就是在对目标miRNA进行RT-qPCR的时候，同时检测另一个低分子量的RNA。比如最常用的U6、U1snRNA，还有5S rRNA、7SL RNA等，以及一些管家miRNA，其中最常用的是U6。与通常mRNA反转录PCR不同，针对特定miRNA检测常用的3’端反转录引物常常是茎环引物，以延长模版长度，便于后续的PCR；并且，是特定茎环引物反转录特定miRNA，而后应用染料法或taqman探针法进行PCR。这也意味着一个miRNA RT-qPCR就需要一次反转录，分别PCR，而不是通常mRNA实验中一次反转录，多重PCR。在这个过程中，默认每次反转录效率是相同的。当然，并非每个样品都可以采用同样的内参，合适的内参的基本要求是在细胞中水平保持恒定，不受处理条件的影响，因此需要摸索。特别是在检测血液样本，更是如此。