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前面讨论的主要是irregular工具，它对于大个的孤立图形对象的选取是有用的，而面对组织切片中密密麻麻的细胞，就得用本主题讨论的segmentation工具了。

实际上，在第一部分入门中所用的就是segmentation工具，在那里我用颜色吸管选取了图片中蓝色的细胞核，但是如果仔细观察一下选取的效果就会发现，有一些挨在一起的两个以上的细胞核被识别成了一个，另有一些蓝色的杂质颗粒被错误地识别成了细胞核。如果你试着用吸管工具选取一下图中黄色的免疫反应表达区域，就会发现因为黄色很浅，很不容易准确地选取。所以对于segmentation工具还需要有更多的应用技巧。

让我们还是从打开图片并调出count/size窗口开始吧。

对这种色彩饱和度低，各种成分颜色区别很小的图片来说，只能手工选择AOI了。
选manual，并点select color调出segmentation窗口。窗口里有两个表单，一个是color cube based，另一个是histogram based。我们要选取后者，并且使用HSI颜色格式来进行分色选择。当切换到HSI时，会弹出一个窗口提示你会reset颜色选择，是否继续？当然是OK啦。这时的颜色选择全部重置为0-255。在HSI颜色格式中，H为色调，就是我们眼睛所看到的红橙黄绿青蓝紫等。S为色饱和度，I为强度。在选择AOI时，首先保持S、I为最大范围，从H中选择黄色部分。点一下H，直方图显示就是图片各象素H值的分布，在直方图的两边各有一根线，这就是选择线，先将右边的线用鼠标左键向里面拉，拉一点停一下看看效果，可以看到最开始时是选中了全部画面，然后是蓝色的区域慢慢显露出来，并且越显越多，选择线的位置也在下面的窗口中有显示，是0-255之间的数，共有两个窗口，左边是取值下限，右边是取值上限，先不断减小上限值使得非黄色区域不断地显露出来，再不断增加下限值让另一部分非黄色的区域也显露出来。

这张照片中黄色区域为H：0-33。色饱和度S与强度I都直接设为0-255。这就是说，只要是黄色，就被认为是阳性表达的区域。

选好了颜色范围，点close关闭segmentation窗口，回到count/size窗口，点measure的select measurement ，选中area, density（mean），IOD。坏事了，这个窗口的measure按纽是灰色的，不能用。回到count/size窗口，按count纽，也一样不好用！！！或者点count后计算的区域根本就不是刚才选取的正确区域。这是使用HSI选色时最常犯的错误：只是操作顺序不对，正确的操作顺序是：先打开select measurement，选择好各个测量项目，再回到count/size中点select color进行颜色选取，再回到count/size窗口中点count计数。这样操作结束后仔细观察一下计算的区域，正是刚才正确选取的区域了。

这样选取的区域还是有一点不准确。图片中被选中的区域有许多很小的选点，显然这是各种杂质，并不是成片的蛋白表达区域。对这些杂质小点有一个有效的方法来去除，就是测量过滤（filter）。

打开select measurement窗口，点一下中间被选中测量项目中的area项，使其加亮。这时下面的start与end选项就变黑可调了。对area来说，默认值一般是0，意思是不管区域有多小，都被计入测量范围内。现在我们把它改为50，也就是说，忽略了象素点小于50的杂质点，不予计算在内。改完后点一下旁边的Filter按纽，再点measure按纽，或者回到count/size窗口内把Apply Filter Ranges in Range前面的选项给勾上，再点count按纽，这回就把小杂质点全给过滤掉了。

过滤是一种很有效的选取AOI的手段，除了定义面积范围进行过滤以外，还可以选取BOX X/Y测量项目，这是object外切长方形的长宽比，如果是园形的object，这个值应该是1，在作园形的细胞计数统计时，把这个值的范围设定在0.5到2.0之间，就可以滤掉长条形的杂质Object,当然同时也可以设面积过滤范围。把那些通过颜色选择不能排除的object给进一步排除掉。类似的测量选项还有Radius Ratio等，通过这些测量值的过滤，可使得AOI选得更加准确。

显微镜图象千差万别，每一次进行分析都需根据具体的图像情况来选择AOI方法。前面所述的各种技巧需交替应用。

凡是玩电脑都必会有一个reset键。不管作错了什么事，按一下reset键就可以全部重新来。选AOI也是这样，如果选得不合心意，想全部重新来的话，按count/size窗口中的delete键，就可以把刚才作的一切都给全部推倒重来了。

另外还有一个是反向选择。在选文件夹与word的edit菜单里都有这项功能。segmentation里也有这个哟。在前面的图象里，选好颜色后，点一下用红圈标注的那个按纽，就实现了反向选择。

关于segmentation窗口中其他一些按纽的用处，大家可以从帮助文件中查找。尽管帮助文件是英文的，看起来有点困难，但中文的帮助文件翻译得不准确，有时比英文的还难懂呢。

总结一下segmentation工具的用法，有两种，一种是在color cube based模式中用颜色吸管来选取目标颜色。另一种是在Histogram Based 模式中利用HSI范围来选取目标颜色。二种方法各有其优点，其共同之处就是把图片中相同颜色的区域给定义成一个class，以便对它们进行分析处理。

在segmentation窗口的下方还有一些有用的功能。
在priview框中，上面一个选项是对选择的区域标注ckass颜色的，可以选择不标色，只标当前class颜色（current class）或者所有class颜色。下面一个选项则是对选中区域与非选中区域分别标上不同颜色的选择，我一般选择class color on transparent。这样在选择颜色时能观察尚未被选中的部分。如果把一部分选成black，其效果就等于把这一部分从图象中抠去，这个处理也是很有用的。标注上了class颜色的图象可以点creat priview image按纽来另存成一个新图片。窗口最下方的file按纽是用来保存颜色选取参数的。这个颜色参数文件非常有用。在处理一组多个图片的时候，不能每个图片都选择一次颜色，这样各个图片的选择标准不一致，而且费时间。先处理一张典型的图片，把颜色选择参数保存成一个文件，在处理下一张图片时，只要把这个文件再调出来就行了。这个操作在使用宏操作时是必须的。

关于AOI的技巧的讨论到此结束。请继续阅读下一主题。

编辑：bluelove