多个产物或非特异性扩增产物
转载请注明来自丁香园
发布日期：2011-11-30 11:47 文章来源：<a href="http://www.biomart.cn/longgene/index.htm">杭州朗基</a>
关键词： 丁香园
生物专题
杭州朗基
PCR
产物
点击次数：
发布日期：2011-11-30 11:47 文章来源：<a href="http://www.biomart.cn/longgene/index.htm">杭州朗基</a>
关键词： 丁香园
生物专题
杭州朗基
PCR
产物
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反应成分问题：
| 可能的原因 | 解决办法 |
| 反应管或试剂污染 | 1. 将反应管使用前进行高压灭菌，消除污染的核酸 2. 使用新鲜的溶液和试剂以及新的反应管 |
| 外源DNA污染 | 1. 配置反应液时，使用专用的工作区和移液器 2. 配置反应液时，戴手套操作 |
| 模板过量 | 1. 通过电泳检查模板的浓度 2. 减少起始模板，对于低复杂度的模板（例如质粒、lambda、BAC DNA），每50ul反应使用1pg-10ng DNA；对于高复杂度的模板（例如基因组DNA），每50ul反应使用1ng-1ug DNA |
| 引物退火温度太低 | 提高退火温度 |
| Mg离子浓度过高 | 在1.5-4mM区间按0.2-0.25mM的间隔降低Mg离子浓度 |
| 引物设计的不好 | 1. 查找与本序列相关的文献所设计的引物 2. 确保引物有更高的退火温度 3. 确保引物内和引物间不存在互补 4. 如果原来的引物长度<22碱基，增加引物长度 5. 避免3’端过多的GC 6. 如果原来引物的GC含量少于40%，设计GC含量在40-60%范围的引物 |
| 模板DNA上存在多个引物结合位点 | 重新设计更高特异性的引物 |
| 引物简并度过高 | 降低引物简并度 |
| 引物过量 | 在0.05-0.1-0.5-1uM浓度范围内调节引物浓度 |
| 引物质量问题、不纯 | 只使用高质量的、纯化过的引物 |
| dNTPs过量 | 减少dNTPs |
| 聚合酶浓度太高 | 减少酶浓度 |
| pH条件不够优化 | 检查更高或更低的pH值 |
| 反应缓冲液未混匀 | 充分混匀反应缓冲液 |
反应条件问题：
| 可能的原因 | 解决办法 |
| PCR反应前的预复制 | 1. 使用热启动聚合酶 2. 在冰上配置反应混合物，待热循环仪预热到变性温度时再放样品 |
| 变性温度太高或太低 | 按1℃的变化量调节温度 |
| 退火温度过低 | 1. 使用可靠的方法重新计算引物的Tm值 2. 按2-3℃的变化量增加退火温度 |
| 延伸时间太长 | 较少延伸时间 |
| 循环数过多 | 减少循环数 |
| Ramp速率太低 | 提高Ramp速率 |
策略：
1. 使用巢式引物
2. 使用两步PCR
3. 使用热启动
4. 使用降落PCR
编辑: cq