PCR过程中污染的防治
发布日期：2011-11-29 16:09 文章来源：<a href="http://www.biomart.cn/longgene/index.htm">杭州朗基</a>
关键词： 丁香园
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PCR
污染防治
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1. 分区、分试剂
为防止从PCR反应间的污染的扩散，最好将PCR实验室分区或者分成多个房间。准备引物、PCR缓冲液和dNTP，除加入模板DNA操作的准备PCR阶段在第一个区域（或房间）进行；处理样本、制备模板DNA和将模板DNA加入PCR反应体系中应在第二个区域（或房间）进行；进行PCR循环在第三个区域（或房间）进行；琼脂糖凝胶电泳和紫外拍照应在第四个区域（或房间）进行。每个区域最好配备专用的移液器等用具。不要将扩增产物重新拿回前面三个区域（或房间），以防污染。
每个实验人员分别有一套PCR试剂（酶、PCR缓冲液、引物等），这样不会因为相互间换用试剂而带来交叉污染，即使出现污染也容易排查。
2. 器具灭菌
重复性使用的玻璃和塑料器皿可用0.5M的盐酸在常温下浸泡1小时后用水冲洗干净，再高压灭菌。
3. 污染排查
当阴性对照有条带，表明一种试剂或者枪头污染。此时可首先清洁枪头并丢弃最便宜的试剂然后重新进行，如果问题仍然出现并且没有时间查明原因，丢弃所有试剂重头开始；
4. 消化聚合酶中污染的大肠杆菌DNA
从基因工程大肠杆菌内提取得质量不高的Taq酶可能污染大肠杆菌的基因组，这时可用DNA酶在37℃消化（10min），然后在95℃（5min）灭活DNA酶；
5. 试剂分装
为减少污染的可能性，应将购买回的昂贵的试剂（dNTP、引物等）分装成小份。将无菌的蒸馏水分装成足够每次使用的份数，放于无菌的PCR管中，每次使用后丢弃。
6. 减少多次PCR实验间的相互污染
另外一种方法通过使用酶来降解上次循环中产生的扩增产物确保防止本次实验中不会污染上次实验的扩增产物。使用dTTP的类似物dUTP加入反应混合物中，结果产生的PCR扩增产物包含掺入的dUMP。如果靶基因混入了上次循环的污染物，则在正式扩增前使用特定的酶uracil N glycosylase（尿嘧啶N糖基化酶）进行消化，这种酶可以将污染的扩增产物链的尿嘧啶切下，因此在正式扩增前使污染物降解，而靶基因则不会被消化，因而保证了反应的特异性。加入的酶则通过预变性步骤加热而失活，不会干扰后续的PCR反应。
编辑: cq