引物设计原则
发布日期：2011-11-29 16:20 文章来源：<a href="http://www.biomart.cn/longgene/index.htm">杭州朗基</a>
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引物设计
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引物的Tm（解链温度）值大小决定PCR过程退火温度的高低。引物的Tm随引物长度的增加而增加，一般小于20bp的引物可以简单的按下列公式计算引物的Tm值：Tm＝2×（A+T）＋4×（C+G）；当引物长度超过20bp时，可使用在线的Tm计算器计算。采用最临近分析方法（nearest neighbor method）的Tm计算器能够给出比较准确的Tm值。对于进行PCR试验而言，最优的引物Tm值一般在55-65℃之间。
如果选取的引物长度太短，当扩增较长的模板链时，引物可能与模板链上多个位点结合，导致非特异性产物的产生。引物也不能太长，太长的引物的Tm值如果可能超过80℃，超过了聚合酶的最佳活性温度。
当靶DNA的序列未知，而知道其它物种的相似序列时，可以设计简并引物来尝试扩增靶DNA。简并引物实际上是多种引物的混合物，引物之间序列彼此相似。使用简并引物使PCR的特异性降低，造成产物的量减少或非特异性产物的扩增。
一般来讲，引物的设计要遵从以下原则：
1. 确保引物设计和订购时方向正确；
2. 长度18-30个碱基，过短特异性不够，在DNA上有许多结合位点，过长则成本过高。
3. GC含量应在40-60%之间；
4. 两引物计算出的Tm值相差应小于3-5℃，尽管有时候超过5℃的差异也能扩增出产物；
5. 连续相同碱基重复不应超过3个（GGGG）；
6. 避免回文或反向重复序列；
7. 避免单引物自我互补形成的发夹结构（hairpin），引物间的互补序列长度不应超过8个碱基；
8. 避免引物间有潜在的碱基配对互补区，特别是引物的3'端。引物3'端是保证PCR成功的关键，3'端与其它引物的互补区不应超过3-4个碱基，并且应该与模板链完全互补；当使用简并引物时，要尽量减少3'端的简并度，以提高引物的特异性。
9. 由于聚合酶对远离3'端的错配容忍度较高，可在引物的5'端引物非互补序列，例如引入限制性酶切位点，方便扩增后使产物与载体片段相连。
编辑: cq