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研究生课题在学科的发展中作用巨大，也是学科进展的体现……
以下是丁香园论坛呼吸科网友就自己的硕/博士课题进行交流。

网友[king312312312]：

课题题目:
γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶及其信号通路在慢性阻塞性肺疾病中的作用
研究方向:
慢性阻塞性肺疾病
课题来源:
1. r-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因调控对慢性阻塞性肺疾病的作用。湖南省科技计划项目。编号:01JZ201 。负责人:戴爱国。2003.1-2006.12
2.慢性阻塞性肺疾病的易感基因研究。湖南省医药卫生科研课题。编号：B2003-110 。负责人:戴爱国。2004.1-2006.12
研究方法:
一.模型和分组:健康雄性Wistar大鼠28支,随机分COPD组和对照组，用每日烟熏
法制备模型.
二.γ-GCS活性:在终体积为1ml的反应体系中340nm处观测吸光度值的变化。通过NAD—形成的速率表γ-GCS活性，1个单位（1U）=1nmol/min/mg蛋白.
三.原位杂交: γ-GCS寡核苷酸探针：地高辛标记的多聚核苷酸探针.实验步骤按试剂盒说 明书操作。阳性结果为胞浆中出现棕黄色。显微显影系统（日本Olympus公司）采集图像，测定光密度（OD值）（全自动图像分析系统ULTRA-VIOLET PRODUCTS）。
四.免疫组化:常规脱腊至水、抗原修复及兔血清封闭,加一抗,生物素标记羊抗兔IgG，SABC孵育，DAB显色，苏木素复染后，脱水封片。
五.Western blot分析:-80℃冰箱中取组织，加裂解液冰上研磨。4℃离心，沸水变性，BCA法蛋白定量。各取30μg蛋白经10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移法转膜，5%脱脂奶粉加TBST封闭2小时，加一抗1：1000室温孵育1小时，与1：1000辣根过氧化物酶室温共育1小时后，化学发光试剂盒显色滤膜，于暗室X线底片压膜显影.
六、统计学处理:采用SPSS 10.0软件进行组间t检验和相关分析。
研究结果:γ-GCS在COPD的发病过程中起重要作用,其机制可能是通过其抗氧化作用而在COPD患者的氧化/抗氧化失衡中起抵抗作用.[[我们的γ-GCS上已取得了系统性研究,分别在中华结核呼吸杂志(2篇已发表,1篇审稿中),中国病理生理杂志(1篇),国外医学内科学分册(1篇),国外医学呼吸分册(1篇)]].

网友[danieljh]：

课题题目:自拟加味定喘汤雾化对小鼠气道炎症的抑制作用

研究方向：实验采用复方中药溶液雾化吸入小鼠哮喘模型，观察气道炎症及局部T辅助细胞亚群的改变，探讨该复方中药溶液对小鼠气道炎症有无抑制作用及其对小鼠T辅助细胞亚群功能的调节作用，探索中西医结合治疗支气管哮喘的新途径。

课题来源：市卫生局课题

研究方法
1.材料/对象；选取成年近交系BALB/c小鼠，随机分成三组：中药组（TCM）,地塞米松组（Dex）,对照组；
2哮喘模型的复制：用OVA致敏小鼠，经一段时间，再对其进行激发；
3在哮喘模型致敏后进行激发过程中，分别对各实验组施以如下处理：
TCM组：将所选中药方剂制成溶液并稀释成一定浓度雾化小鼠，共17天，
Dex组：将地塞米松按0.5mg/kg/d，腹腔注射(i.p)，共17天，
对照组：仅用PBS雾化小鼠；
4最后对实验小鼠检测如下指标：行支气管肺泡灌洗，检测灌洗液（BALF）中细胞总数及细胞分类计数，尤其注意嗜酸性细胞的百分比；检测BALF中IL-4、 IL-5和IFN-γ水平；检测小鼠血清中IgE、IgG4水平；制备肺组织标本，用光镜及电镜观察气道炎症改变；用免疫组化方法及原位杂交方法检测气道标本中IL-4、 IL-5和IFN-γ的表达。

主要仪器：PCR扩增仪、CO2培养箱、高速低温离心机、超薄切片机、超净工作台等

统计学方法：实验结果以均数±标准差（x±SD）表示，采用SPSS11.0统计分析软件包。各组样本均数先进行方差齐性检验，若方差齐同，采用单因素方差分析，如果各组均数间差别有显著性，用最小显著差法（LSD法）在分组均值之间作成对比较；若方差不齐，采用多个样本比较的秩和检验，用Games-Howell法作有时自由的成对比较。以P<0.05判定有无显著性差别。

研究结果或预期研究结果
1．中药雾化能抑制小鼠气道炎症
2．中药雾化抑制气道炎症的机理是通过对小鼠免疫系统的调节达到

网友[wlfohz]：

课题题目:肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌质粒AmpC酶及ESBLs的检测

研究方向：了解本市临床分离的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌产质粒AmpC酶及ESBLs以及耐药性分布情况。

课题来源：市卫生局课题

研究方法： 收集本市四家医院共300株肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌，K-B纸片法检测药敏情况，筛选出对三代头孢耐药的菌株，表型确证试验确定产ESBLs菌株，筛选出对头孢西丁耐药的菌株，酶粗提物三维试验粗筛出产AmpC酶菌株。

研究结果或预期研究结果
本市临床分离的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌产ESBLs率分别为34.7%、40.0%；粗筛产AmpC酶菌株肺炎克雷伯菌3株，占1.76％，大肠埃希菌2株，占1.54％，其中1株产AmpC酶肺炎克雷伯菌菌株同时产ESBLs。

网友[wuyuning]：

课题题目：屋尘螨口服DNA疫苗的构建及对哮喘小鼠肺组织炎症的作用

研究方向：支气管哮喘的免疫治疗

课题来源：无

研究方法：1、携带有屋尘螨主要抗原Der p1／Der p2基因质粒的减毒沙门菌构建；
2、屋尘螨致敏哮喘模型的复制；
3、DNA疫苗-减毒沙门菌干预动物：方法分别采用口服、滴鼻、肌注等
4、相关指标检测：肺组织病理学、肺泡灌洗细胞分类计数及上清液相关细胞因子检测；

预期结果：该疫苗可以对肺组织炎症起保护作用。

网友[daisy]：

课题题目:老年人医院内肺炎的危险因素：多中心前瞻性队列研究

研究方向：了解老年人医院内肺炎（HAP）的发病率、临床特征，筛查并确定老年人HAP发病危险因素尤其是高危因素，为制订老年人HAP综合干预措施提供依据。

课题来源："十五”国家科技攻关项目“老年人下呼吸道感染综合干预的研究”的子课题

研究方法:
多中心前瞻性队列研究。31所医院的感染专职人员作为本研究调查员。2004年3 -6月，新入院的老年病人作为本研究对象，统计分析老年人HAP的发病率及相关危险因素。调查员每周至少去床旁检查病人3次，并按日期记录病人的症状、体征、实验室及其他相关辅助检查情况。对疑似肺炎病例，即作X线胸部摄片以明确诊断。
HAP诊断标准：采用中华医学会呼吸病学会1999年制定的医院内肺炎诊断标准。未发生肺炎者则观察至病人出院、或死亡、或住院日期达42天为止。
不论有无肺炎，均按表格预设要求，详细登记病人入选时的基本情况、基础疾病及住院期间的其他易感因素，并在调查结束时记录疾病预后情况。

统计学方法：采用SPSS 12.0软件。HAP危险因素的单因素分析应用Pearson Chi-Square方法。多因素Logistic回归分析以HAP为应变量, 所有可能的危险因素作为自变量进入Backward（Wald）多因素Logistic 回归分析。 每一步变量进入回归方程检验水准A< 0.05, 变量剔除出回归方程检验水准A > 0.10, 由此确定HAP发病的独立危险因素、似然比 (odds ratio，OR) 及95%可信区间（95％CI）。

研究结果:共入组5299例老年病人。单因素相关分析，筛选出HAP发生的16项可能危险因素：入住二级医院或ICU、年龄>75y、体型肥胖或消瘦、COPD病程≥10年、心肺功能差、肝硬化失代偿期、脑卒中或脑外伤、免疫抑制、APACHE II评分>10分、入院后使用抗菌药物或制酸剂、鼻胃管留置、机械通气、意识障碍、卧床（活动受限）、血清白蛋白<35g/l。多因素Logistic回归分析发现除年龄>75y、体型肥胖或消瘦和APACHE II评分>10分外的其他13项为老年人HAP发病的独立危险因素。

结论：老年人HAP是临床上常见的医院感染类型。ICU发病率超过20％。发病危险因素众多，需要综合预防才能有效降低其发病。老年人HAP的粗病死率低于以往的估计值（20％～50％），可能与临床救治综合水平提高有关。

网友[zhangjianss]：

题目 屋尘螨和FasL基因重组转染的树突状细胞诱导哮喘小鼠免疫耐受的研究
目的和意义：
1、通过将屋尘螨抗原Derp2和Fas抗原配体（CD95L）的cDNA共转染树突状细胞（DC），构建能诱导T细胞凋亡的“杀手”DC，观察“杀手”DC诱导哮喘小鼠抗原特异性T细胞凋亡和影响细胞因子产生的作用，并观察其对屋尘螨致敏哮喘小鼠的气道炎症、细胞因子产生的影响，
2、以屋尘螨抗原Derp2的cDNA转染DC，观察该DC在体外诱导哮喘小鼠抗原特异性T细胞凋亡和影响细胞因子产生的作用，并观察其对屋尘螨致敏哮喘小鼠的气道炎症、细胞因子产生的影响。
3、通过比较“杀手”DC与Derp2转染DC的诱导体外T细胞凋亡和治疗哮喘小鼠气道炎症作用的比较，研究“杀手”DC诱导外周免疫耐受的作用和机制。

国内外研究现状及发展趋势：
支气管哮喘是全球最常见的慢性疾病之一，全世界约有 1亿 5千万哮喘患者。研究显示，目前哮喘患病率大约以每年 1%的速度递增 [1]。哮喘的发病机制仍未完全了解。现已阐明，哮喘是多种细胞参与的气道慢性炎症性疾患。大多数哮喘为过敏性哮喘，其发病均与变应原的作用有关。
正常人在反复接触过敏原后，T淋巴细胞能对过敏原的刺激产生免疫耐受，不会导致抗原特异性淋巴细胞活化，始动哮喘的发病过程。而哮喘患者则相反,当机体初次接触过敏原后, 机体产生记忆的特异性T细胞。当机体再次接触该过敏原后，记忆性的特异性淋巴细胞不发生调亡，而是活化、增殖、分化为Th2细胞,产生大量Th2细胞因子,始动哮喘发病。所以，我们认为机体对过敏原的免疫耐受机制缺陷是哮喘发病的关键环节。因此，研究哮喘免疫耐受缺陷的机制，研究逆转这种缺陷的途径和方法对哮喘的防治有极为重要的意义。
T细胞应答是机体对抗原产生免疫反应或免疫耐受的关键环节。一方面，DC不仅能摄取、加工和处理抗原，而且是惟一能活化naive T细胞的抗原呈递细胞；另一方面，不同的DC亚群以及处于不同成熟阶段的DC所表达的免疫分子或分泌的细胞因子决定了机体发生免疫反应的类型,包括诱导免疫激活或免疫耐受。因此，DC在诱导T细胞活化或耐受的过程中发挥了十分重要的作用。目前研究表明，DC在哮喘的T细胞的活化和分化中起着关键的始动作用［2,3］。变应原进入机体后，DC不仅能识别、摄取和加工抗原，而且能将抗原呈递给幼稚T细胞，表达共刺激分子和某些细胞因子等各种物质来影响幼稚T细胞的活化和分化，引起T细胞分泌前炎症性细胞因子，引起气道的变态反应性炎症。但是，DC在机体对抗原的免疫耐受也起着重要作用。DC与哮喘患者对抗原的免疫耐受关系又如何？目前研究表明，DC与免疫耐受的关系非常密切，DC无论是中枢耐受还是外周耐受的诱导过程中均发挥了重要作用。研究发现，未成熟DC很可能在诱导免疫耐受中发挥重要作用。但是DC与哮喘患者对过敏原的免疫耐受机制缺陷的关系仍不清楚。
过敏原特异性免疫治疗(specific immunotherapy treatment,SIT)作为目前唯一对因治疗支气管哮喘的有效疗法已被许多国内外的临床试验所证明，并在临床上得到了广泛应用，但其作用机制仍不完全清楚，可能与其调节Th1/Th2细胞的平衡，减弱Th2型过敏原免疫应答有关[4]。在动物实验中发现吸入过敏原的初期可导致IgE升高，但持续吸入抗原则可以逐渐恢复正常，这种现象被国外学者称为对吸入变应原的“免疫耐受” [5,6]。哮喘多在儿童时期发病，但约2/3的患儿成年后哮喘自愈，也提示部分哮喘患者随身体的发育可以逐渐对变应原产生“免疫耐受”。在我们呼吸疾病研究所过去承担的国家自然科学基金项目“过敏原诱导哮喘T淋巴细胞不反应性的机制研究”中发现大剂量的抗原可以诱导哮喘动物的T细胞产生不反应性[7]。 所以，我们认为哮喘体内Th1/Th2偏移只是一种“表面”的现象，其深层的原因是机体对变应原的“免疫耐受”机制异常和/或缺陷。DC是机体首先接触过敏原的免疫细胞，它的功能异常是导致机体对过敏原不能正常的产生“免疫耐受”，是导致哮喘发病的关键环节。DC正在成为哮喘治疗的新靶点[8]。
Fas/Fas配体(FasL)介导的T细胞凋亡是机体维持对自身抗原免疫耐受（外周耐受）的重要机制。Zhang等报道[9]，在体外将携带FasL的腺病毒载体转染巨噬细胞经静脉注入同基因的动物，可诱导T细胞对腺病毒相关的抗原免疫耐受。国外有文献将Fas配体（CD95L）基因转染到DC[10]和单核细胞[11]诱导T细胞凋亡，导致对相关抗原的不反应性。这种诱导T细胞凋亡的DC被称为“杀手”DC。 在本项目中我们设想在国外的研究和我们呼吸研究过去研究过敏原DNA疫苗的基础之上，将过敏原DNA疫苗与Fas配体转染DC的策略结合起来。一是将屋尘螨抗原Derp 2 cDNA转录DC，使其自身产生大剂量的过敏原，诱导免疫耐受；二是将诱导T细胞凋亡的Fas配体CD95L基因转导DC。这样DC即表达大量过敏原也表达CD95L，当DC将抗原提呈给T细胞时，其细胞表面的CD95L可以与抗原特异性T细胞表面的Fas抗原结合，从而诱导特异性的T细胞克隆发生凋亡，大量消耗特异性的T细胞克隆，产生对特异性过敏原的免疫耐受。类似的研究在国内外尚未见报道。如果该策略能获得成功将为哮喘的防治提供新的思路和途径。
要解决的主要问题和关键技术
要解决的主要问题：通过双基因重组载体转染DC，产生能同时表达的Derp2抗原和FasL的DC-Derp2-CD95L，该DC能够诱导哮喘小鼠对过敏原特异性的免疫耐受。
关键技术：1、重组双基因共表达载体的构建
　　　　　2、重组双基因共表达载体转染DC
3、重组表达Derp2 cDNA载体转染树突状细胞；
4、屋尘螨抗原致敏哮喘小鼠模型的制作
　　　　　5、小鼠骨髓来源的树突状细胞和脾脏T细胞的分离与培养
　　　　　6、ELISA法测定各细胞因子
　　　　　7、免疫组化测定DC表面的CD80、CD86
　　　　　8、RT-PCR

网友[chunlixiao]：

课题题目:胃食道返流性咳嗽发病机制的探讨—神经源性炎症的作用

研究方向:慢性咳嗽与支气管哮喘发病机制

课题来源: 国家自然基金,广州市科技局重点攻关项目
研究方法
材料/对象:豚鼠，体重250-350g
主要方法:
1.辣椒素预处理为去除NANC速激肽，豚鼠被预先用辣椒素处理，方法如下：①辣椒素（40mg/kg,sc）或安慰剂注射，注射前给予氯安酮（50mg/kg，im）、氨茶碱（10mg/kg，ip）和舒喘灵（0.2mg/kg，sc），以减少注射辣椒素引起的支气管收缩和疼痛反应；②5天后重复前面的步骤；③第二次辣椒素注射后一周，动物用于下一步实验。
2.动物食道盐酸灌注方法①戊巴比妥钠（25mg/kg）腹腔内注射麻醉动物；②颈动脉插管监测血压，收集样本用于血气分析。颈静脉插管用于注射药物；③根据分组需要，盐酸灌注前30min通过静脉给予碱胆能受体阻断剂阿托品、b肾上腺素能受体阻断剂心得安或生理盐水。阿托品（1mg/kg）、心得安剂量（1mg/kg）参照文献（Belvisi MG, et al. J Appl Physiol 1989;66:268）。④   在第5气管软骨环的水平上，食道插入一导管用于盐酸灌注，结扎食道上下二端以防盐酸渗漏。⑤ 根据分组需要，盐酸灌注前3min通过静脉给予特异性速激肽受体拮抗剂：NK1受体拮抗剂FK-888、NK2受体拮抗剂SR 48968、NK3受体拮抗剂SR 142801和/或CGRP受体拮抗剂CGRP(8-37)。⑥ 有phosphormidon预处理组动物食道灌注前5min静脉注射中性内肽酶（NEP）抑制剂phosphormidon，观察速激肽降解被抑制的情况下（模拟合并气道上皮损伤），盐酸刺激食道NANC介导的气道炎症的作用。⑦所有动物食道灌注前1min静脉注射伊文思兰（30mg/kg）,随后灌注1N盐酸（0.4ml）或等量生理盐水并留置1min,10min后取材用于检测。
3.气道微血管渗漏的检测原理为通过检测组织的伊文思兰染料渗漏情况，反映微血管透性和炎症的变化，具体方法参考文献（Saria A, et al. J Neurosci Methods 1983;8:41-49）。① 打开胸腔，右心房切一小口，从左室插入针头，逆行灌注生理盐水至清亮。用于原位杂交的动物再用4%多聚甲醛灌注固定。②取出肺脏，清除血管、结缔组织，分为三部分：气管部分、主支气管部分、肺泡组织部分。吸去多余水分，称重。③ 甲酰胺37℃24h提取伊文思兰染料，测定620nm吸光度，根据标准曲线计算组织染料浓度。
4.气管组织炎症变化光镜观察①取少许气管和支气管组织进行石腊包埋切片。②HE染色，光镜观察组织充血水肿及炎性浸润情况。6）肺组织速激肽含量的检测① 肺组织称重，匀浆，离心取上清。② 放射免疫法检测上清SP、NKA、NKB、CGRP水平。③ 具体方法参照试剂盒说明。
主要仪器:荧光显微镜、r-计数器、721分光光度计、酶标仪
统计学方法……SPSS11.0统计软件，单因素方差分析

研究结果或预期研究结果：
1.食管灌注盐酸可以引起气道速激肽释放，速激肽导致气道血浆渗出，NK1受体拮抗剂对此有部分阻断作用。
2.食管和气管之间有神经通路相联系，气道快适应感受器（RARs）和C神经纤维参与盐酸灌注食管所致的气道血浆渗出，反射通路部分由迷走神经介导。
3.该食管-支气管反射及其相关的神经源性炎症可能是GERC的重要发病机制。

网友[lading2004]：

课题题目：肌肉注射mIL-12质粒对小鼠哮喘模型气道炎症及细胞因子的影响

研究方向：哮喘发病的免疫学机制及免疫学治疗探讨

课题来源：浙江省科技厅项目

研究方法：
材料：1、动物：BALB/c小鼠；2主要试剂及仪器：mIL-12质粒、卵白蛋白(OVA)、细胞因子试剂盒、雾化器、酶标仪等
主要方法：1、小鼠哮喘模型的建立：每鼠以 0.1%卵白蛋白溶液(10%氢氧化铝凝胶配制)100ml的剂量，注射于两后爪皮下致敏；10天后（实验第11天）用等量卵白蛋白溶液作腹腔注射加强致敏。第15天将小鼠置于一密闭容器内，以1%卵白蛋白溶液(生理盐水配制)雾化攻击，每天一次，每次半小时，连续7天。
2、实验动物分组及处理：哮喘模型组（8只）：详见哮喘模型的建立。模型对照组（6只）：以生理盐水代替1%卵白蛋白溶液作雾化攻击，余处理与哮喘模型组相同。mIL-12质粒预防组（8只）：首次致敏同一天(实验第1天)，每鼠先取25%蔗糖50ml作腿部肌注， 15分钟后再在同一部位肌注mIL-12质粒100mg，隔天1次共3次。mIL-12质粒治疗组（8只）：雾化攻击前1天起(实验第14天)注射mIL-12质粒，方法与mIL-12质粒预防组相同。空质粒预防组（5只）：每鼠肌注空质粒100mg三次，方法与mIL-12质粒预防组相同。空质粒治疗组（6只）：每鼠肌注空质粒100mg三次，方法与mIL-12质粒治疗组相同。
3、实验标本的获得与处理：末次雾化攻击24小时后，小鼠断尾取血、涂片、阴干，瑞氏-姬姆萨复合染色，于高倍镜下作淋巴细胞、EOS及中性粒细胞分类计数。断颈处死小鼠，剪开颈部皮肤，暴露气管，于气管正中处剪一小口，插入气管套管。用1ml注射器取D-Hank’s液1ml经气管套管快速冲洗肺泡，回抽液体，如此反复三次，得BALF 0.8ml左右。混匀BALF，取其中50ml加入等量白细胞计数液，低倍镜下细胞计数。余液置4℃、10000转/分离心5分钟，转移上清，分装于Eppendorf管，-80℃低温保存，待测细胞因子。沉淀涂片，干后以亚甲基蓝-伊红染色，高倍镜下作EOS、中性粒细胞及淋巴细胞分类计数。
4、BALF中细胞因子水平测定：采用双抗体夹心法测定，具体按照ELISA试剂盒内附说明书操作。

统计学方法：SigmaStat统计软件中的t-Test Mann-Whitney Rank Sum Test
研究结果： 模型对照组EOS数目和IL-4、IL-5、IFN-g水平分别为（0.01±0.03×108/L、23.6±4.1、62.6±10.2、725.0±59.4 pg/ml）、mIL-12质粒预防组为（0.06±0.04×108/L、42.6±13.1、66.4±13.9、626.0±60.1pg/ml）、 mIL-12质粒治疗组为（0.11±0.12×108/L、38.1±14.4、33.2±5.6、661.0±39.5 pg/ml），与哮喘模型组（2.97±1.20×108/L、122.0±45.1、126±34、435.0±49.2 pg/ml）比较有显著性差异（P<0.01）；mIL-12质粒治疗组和mIL-12质粒预防组分别与空质粒预防组（1.96±0.93×108/L、110.0 ±23.6 、112.0±11.2、464.0±50.8 pg/ml）及空质粒治疗组（2.11±0.90×108/L、88.1±16.6 、107.0±6.4、481.0±64.3 pg/ml）比较均有显著性差异（P<0.01）。提示：mIL-12质粒可能通过调节Th1/Th2细胞平衡而抑制哮喘气道炎症。

网友[wg123456]：

课题题目
哮喘血清致敏人支气管平滑肌细胞Kv变化及其细胞内信号调控机制的研究

研究方向
(电压依赖性钾通道)Kv通道在支气管哮喘发病中所发生的变化，以及所导致的Kv通道对气道平滑肌细胞(ASMCs)兴奋性、基本张力和增生与肥厚的影响作用，为进一步探明支气管哮喘气道反应性(AHR)、气流阻塞和气道重塑发病机制提供试验依据.

课题来源
国家自然基金

研究方法
材料/对象人:气道平滑肌；主要方法,肌张力试验,膜片钳,分子生物学实验,免疫细胞化学实验,流氏...；主要仪器膜片钳；统计学方法:实验数据均以均数±标准差（X±S）表示，两组间比较用t检验完成，多组间的差异性检验采用方差分析，两两比较用q检验.

研究结果或预期研究结果
以期能阐明ASMCs上Kv通道在支气管哮喘发病中所发生的变化，以及所导致的Kv通道对ASMCs兴奋性、基本张力和增生与肥厚的影响作用，为进一步探明支气管哮喘AHR、气流阻塞和气道重塑发病机制提供试验依据。

网友[alma2003]：

课题题目：血管活性肠肽（VIP）在支气管哮喘病人发作前后的变化 及其在食管反流中的作用

研究方向：哮喘发病机制

课题来源：市科技局

研究方法
材料/对象：选择正常对照组和急性期哮喘病人（治疗前后）
主要方法和仪器；（24小时食管PH监测仪，放免分析法，免疫组化分， 逆转录PCR技术，酶标法）测定1、24小时食管PH测定
2、静脉血测定VIP、VIP抗体
3、食管气道粘膜VIP
4、食管气道粘膜VIP-mRNA
5、肺泡灌洗液测定IL-10

统计学方法：用治疗前后的自身t检验和对照组和实验组的t检验。

研究结果或预期研究结果：以论文及成果鉴定的形式说明：VIP可能参与了哮喘疾病胃食管反流的发生，是引起哮喘的发病因素之一，即由于VIP相关性基因在食管及气道的表达异常，导致了胃食管反流及支气管的痉挛。免疫抑制剂可能通过影响VIP抗体的产生，提高气道IL-10和血VIP的水平及增强VIP-mRNA的表达，而缓解哮喘的发作。临床上可根据VIP水平及胃食管反流状况，指导本病的治疗
简单扼要介绍：开展本课题的研究，探索VIP在哮喘发病多个环节中所起的作用，提供免疫抑制剂治疗的临床与实验依据，并为以后利用T细胞培养技术深入探讨IL-10等细胞因子在哮喘发病中的作用打下基础，指导支气管哮喘的临床治疗。

网友[shiyajie]：

课题题目: 中药复方对肺纤维化鼠模型TGF-β1的影响
研究方向: 中药复方对肺纤维化的影响以及其作用机制
课题来源: 省中医药管理局
研究方法:
1. 材料/对象:体重150克左右的SD雄性大鼠75只，随机分成3组,①空白对照组（25只），②模型组（25只），③中药复方组（25只）.
2. 肺纤维化模型复制：博莱霉素A5(BLMA5) 大鼠肺纤维化模型与人类病变相似，成为国际上普遍采用的方法。方法为大鼠腹腔注射硫喷妥钠2mg/100g体重麻醉，颈部消毒后逐层暴露气管，气管内给予博莱霉素A50.5mg/100g体重加入0.3ml生理盐水气管注入后，立即将动物旋转，使药液在肺内均匀分布，然后缝合皮肤，局部酒精消毒防止感染。
3. 处理:模型组于造模后当天开始每天灌胃生理盐水5ml/100g，并每周复查体重调整剂量；中药复方组组于造模后当天开始每天灌胃中药复方5ml/100g（相当于生药量1.44g/ml），并每周复查体重调整剂量；三组分别于1d、3d、7d、14d、28d各处死5只。
4. 标本收集: 硫喷妥钠麻醉后开胸，于右心室插入带套管的针，拔出针头，左心耳剪一约2mm左右切口，同时套管与输液器相连，向右心室内灌注加入肝素的生理盐水，直至将肺内血液冲洗干净，肺组织洁白。结扎心脏大血管，分离右肺下叶，注入10%中性福尔马林2-3ml，见胸膜展平，结扎气管后置10%中性福尔马林中固定，常规脱水，石蜡包埋。分离左肺并向支气管内灌注生理盐水5ml共6次，收集支气管肺泡灌洗液（BALF），将BALF用单层无菌纱布过滤以去除粘液，1500r/min离心，10min取上清液5ml，放入低温冰箱-20℃～-70℃保存备检测。
5. 检测指标:
1). 病理组织学观察. 即将肺组织常规包埋、固定、HE染色、Masson染色。根据Szapiel等的方法确定肺泡炎和肺纤维化的程度。
2). 形态定量分析. 即通过计算机图像分析仪灰色分辨率为256灰级，将肺组织HE染色病理切片由浅到深分为256个灰度，根据肺泡腔、细胞核、肺间质纤维化灰度的不同将病理切片区分为无染色区、深染色区、浅染色区进行分析.
3). 免疫组化. 即免疫组化采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶。标本分别滴加一抗即兔抗鼠TGF-β1抗体，4℃冰箱过夜，滴加生物素化山羊抗兔IgG工作液（SR-9001，二抗），再滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，显微镜下DAB显色，苏木素复染胞核。用PBS替换一抗作阴性对照。阳性反应为胞浆内显棕褐色颗粒，胞核为浅蓝色。用真彩色图像分析仪测定阳性细胞的平均吸光度值（IA）来定量反映TGF-β1的表达强度。
4). TGF-β1蛋白水平测定. 即BALF上清液5ml行酶联免疫检测法（ELISA），采用双抗体夹心ELISA法。根据试剂盒提供的方法反应，终止反应后用酶联仪测450nm光密度（OD），结果与标准曲线比较确定TGF-β1含量。
6. 主要仪器: 彩色图象分析仪,全自动显微摄影设备,MIAS图文报告系统,自动酶标仪,洗板仪,切片机,离心机,–86。C低温冰箱等等.
7. 统计学方法：实验结果以均数±标准差（x±SD）表示，采用SPSS11.0统计分析软件包进行分析.
8. 预期研究结果: 本研究将观察中药复方对肺纤维化鼠模型TGF-β1的影响，阐明其作用机制，为在临床上的应用提供理论依据。同时为扩大中药复方在临床上的应用范围提供依据。

网友[zhanganqi]：

一 题目：APC基因甲基化与非小细胞肺癌关系的研究
二 研究方向
APC在NSCLC发生发展中的作用。
三 来源 省自然科学基金
四 研究内容
研究非小细胞肺癌不同病理类型、不同细胞分化程度、不同病理分期与瘤旁正常肺组织中APC异常甲基化和caspase表达之间的关系，结合Western blot、流式细胞分析，阐明APC基因在肺癌细胞凋亡中的作用。检测非小细胞肺癌病人血清DNA中APC基因异常甲基化的发生率，探讨血清APC基因甲基化检测在肺癌诊断中的应用价值。
五 拟采取的研究方法、技术路线、实验方案。
1 研究方法
⑴ 细胞培养：基本步骤为：复苏、培养、传代。
⑵ 甲基化特异性PCR（MSP）检测：DNA的提取及纯化——亚硫酸氢钠处理——加入两对甲基化PCR引物——加入TapDNA聚合酶及dNTPs——PCR扩增（95℃变性、60－62℃退火、70℃延伸，共计35个循环）——产物加入琼脂糖凝胶——电泳——紫外监测仪下观察并拍照。
⑶ RT-PCR检测ASC基因表达：RNA提取——cDNA第一链合成反应（样品RNA、逆转录酶AMV、dNTPs、RNA酶抑制蛋白、下游引物）——42℃反应60分钟、99℃灭活并使DNA、RNA杂和分子变性解离——PCR扩增反应（cDNA、上游产物、TaqDNA聚合酶——适当温度扩增35个循环并延伸——琼脂糖电泳——紫外线监测仪观察并拍照。
⑷ MTT分析：培养细胞接种于96孔培养板——设定空白孔和对照孔——加入不同的处理因素——继续培养24小时——加入MTT——继续培养4小时——加入DMSO——SPECTRA2型酶标仪以570nm检测波长检测各孔吸光度（OD值）——计算细胞增殖抑制率。
⑸ 流式细胞分析：培养细胞接种于6孔板（多板培养以使达到一定的细胞数）——设对照孔——加入不同的处理因素——培养24小时——弃去培养液——4℃预冷PBS洗涤吹打成细胞悬液——移入离心管离心——弃上清——-20℃预冷的70％乙醇固定48小时——离心——PBS重悬再离心——弃上清——PBS重悬——加Rnase混匀37℃作用45分钟——离心并用PBS洗去Rnase——PBS重悬并加PI染液4℃避光1小时——FACS流式细胞仪测荧光强度（每次至少104 个细胞）——采用Cellquest分析软件进行细胞周期DNA含量分析——计算机打印成图。
（6）免疫组化技术。
2 技术路线
⑴ 采用手术切除并冷冻保存的非小细胞肺癌肿瘤组织和其对应的瘤旁正常组织，应用MSP和RT-PCR技术检测癌组织和癌旁正常组织中APC基因的甲基化特征以及APC基因的表达，通过统计学分析，阐明APC基因甲基化与非小细胞肺癌临床生物学特性（如病理类型、分期、细胞分化程度、淋巴结转移等）之间的关系。
⑵ 应用MSP方法筛选具有APC基因甲基化的细胞系。培养含有APC基因甲基化的细胞系，加入去甲基化试剂5-AZA-CdR，应用RT-PCR方法检测APC基因的重新表达，并用用MTT、电镜以及流式细胞仪检测APC基因的重新表达与对照组相比是否促进了肿瘤细胞的凋亡。
⑶ 在上述细胞系培养过程中，同时加入5-AZA-CdR和化疗药物Vp－16， 用MTT、电镜和流式细胞仪检测基因APC的重新表达是否增加了肿瘤细胞的化疗敏感性。
六 预期研究成果
由于APC作为促凋亡基因在肺癌中存在因甲基化而导致得静默，因此，我们预期的研究成果是 ①APC基因异常甲基化与非小细胞肺癌的发生发展有关；②血清DNA中APC基因甲基化可以作为非小细胞肺癌诊断的分子生物学指标。

编辑：西门吹血