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我们在实验过程中很多时候都要用到细胞活性测定技术，现在常用的细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。

请您以自己实验过程中的亲身经历对目前使用的细胞活性测定方法做一客观评价，可以介绍自己对各种细胞活性测定方法的理解，每种方法的优缺点，自己实验过程中的小技巧，实验中的经验教训，您所知的其它细胞活性测定方法等等。

网友[xiaoba_008]：

细胞活性测定方法介绍和使用探讨：
细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。

现就这三种四氮唑盐类方法作一个简单介绍：

1、MTT法
MTT：化学名： 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲臜的有机溶剂对实验者也有损害。

2、XTT法
XTT：化学名：2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]
-2H-tetrazolium hydroxide，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲臜产物。当XTT与电子偶合剂（例如PMS）联合应用时，其所产生的水溶性的甲臜产物的吸光度与活细胞的数量成正比。
优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT。
缺点：XTT水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用。

3、CCK-8法或称WST-8法
CCK-8试剂中含有WST–8：化学名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（Formazan）。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。

优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT；5、对细胞毒性小；6、为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。

缺点：1、与MTT相比，CCK-8和XTT的价格比较贵。2、CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。

三种方法的比较

	MTT法	XTT法	CCK-8法（WST-8法）
甲臜物水溶性	难溶性	水溶性	水溶性
检测波长	490 nm	450nm	450nm
性状	粉末	2瓶溶液	1瓶溶液
使用方法	配成溶液后使用	现配现用	毋需预制
使用有机溶剂	DMSO或其它溶剂	—	—
方便性	+	++	+++
检测速度	+	++	+++
重复性	+	++	++
稳定性	++	+	++
工作量	---	--	-
对细胞毒性	---	--	-
对人体毒性	---	-	-

网友[Xcoli]：

用流式细胞仪测定细胞活性的方法：
细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。

核酸染料有多种，如EB带有单个自由正电荷，能通过完整细胞膜。而PI，TO—PRO—1，TO-PRO-3等等带一个有四铵基团和两个或两个以上正电荷的染料是不能通过完整细胞膜进入细胞内的。因而吸收了这些多电荷染料的细胞被认为是非活性的。另外，一些酸性染料，如上面提到的台盼兰，曙红等都是膜非通透性。

代谢活性是另一重要指标，它通过细胞内的酶的活性来判定。使用细胞某种酶的底物，它能通过（或是不能通过）完整细胞膜，在细胞内被酶切而产生荧光性，膜不通透性产物，能在细胞膜完好的细胞内存留，在细胞膜不完整的细胞内散失很快。通过检测荧光强度就可知细胞代谢活性。FDA(fluorescein diacetate)和CTC（5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride）是常用的两种底物。前者虽然透过细胞膜的速度较慢，但它的产物基本不往外通透。后者经细胞内脱氢酶催化而具有荧光性，能提供细胞呼吸代谢系统活性和细胞膜完整性信息。

正常细胞的细胞膜两侧维持着一个胞内为负的膜电位为梯度，带正电的亲脂性染料，如Cyanines类能因电梯度而通过细胞的脂双层膜聚积在活细胞内，带负电的亲脂性染料如oxonols会被排除在外。不再维持着膜电位梯度的细胞里，则会吸收更多Oxonols类染料。

用流式细胞仪测量的方法优点是，灵敏，荧光强度精确定量，快速高通量的检测逐个细胞，可同时检测细胞的多个活性指标，提高可信度，结果具有统计意义。 缺点是，实验较MTT等复杂，费用较高，而且没有流式细胞仪的地方没法采用这种方法。
  
网友[gingseng168]：

MTT法显色的条件是很重要的，这一点容易被我们所忽视，我总结了一下MTT显色反应的一些合适条件， 与大家一览。
1、pH 值对MTT 实验结果的影响：MTT 实验体系的pH 值是影响实验结果的另一重要因素。在偏碱性的环境中本底偏高，稳定性较差。随放置时间延长而升高;偏酸性试液 的实验结果比较稳定。
2、酚红和血清对MTT 实验方法的影响：酚红是一种pH 中性指示剂，血清是细胞生长必需的营养成份，两者都是细胞培养液的基本成份。酚红在pH7.0
以上试液中呈紫红色，在570 nm 有较大光吸收值。血清蛋白在有机溶剂中容易变性形成絮状沉淀，影响透光度。
3、异丙醇等用作Formazan 溶剂，无须酸化也能消除酚红的影响： 为了消除酚红对MTT 实验结果的影响，Mosmann （1983） 提出用酸化异丙醇作Formazan 溶剂，酸化异丙醇可将酚红显示的紫红色转变为无色。Francois （1986） 认为酸化异丙醇溶解Formazan 改变了原光谱特性，降低灵敏度，提出改用无酚红的培养基。未经酸化的异丙醇在一定条件下也可以消除酚红的影响。异丙醇等有机溶剂本身为弱酸性 ，能够中和中性和弱碱性试剂，如RPMI21640 （pH7.3） 。当异丙醇与RPMI - 1640 的溶量比达到1∶1 以上时即可将酚红的紫红色转变成无色。
4、胞代谢酶存在部位对MTT 实验结果的影响：细胞线粒体产生的琥珀酸脱氢酶是细胞生长代谢产物，这种酶裂解MTT形成Formazan 是MTT实验方法的理论基础。琥珀酸脱氢酶的产生和分布规律与MTT检验方法的灵敏度和稳定性有很大关系
5、MTT使用浓度选择：在不饱和状态下，或是细胞密度一定，MTT 不饱和;或是MTT一定，细胞密度不饱和，Formazan 的生成量分别与MTT浓度和细胞分泌的酶活性量呈线性关系。达到饱和状态以后，两者为非线性关系。为了提高MTT 实验方法的灵敏度，在细胞密度一定的条件下，应该使用MTT饱和浓度。MTT的饱和浓度与细胞种类、细胞活力状态有关因此MTT 最佳使用浓度要视情况而定。
6、MTT的酶裂解反应时间选择：MTT 在细胞培养体系中被细胞内线粒体产生的琥珀酸脱氢酶裂解生成Formazan ，完成这一反应需要一定时间。MTT 裂解反应2.5h 反应已基本完成，3 h 反应相当完全，通常MTT实验应选择3 小时的反应时间。

附注（对MTT性质做一些补充说明，它的理化性质对其条件影响很大）：
MTT是一种黄色粉状物，溶于水性溶剂，也溶于有机溶剂，但在有机溶剂中的溶解力低于水性溶剂，常温下需要较长时间才能溶解。MTT 水溶液在pH 7.0 以下稳定，3～5周内不变性，在pH7.0 以上溶液中不太稳定 ，在异丙醇溶液中1 周内变色，2～3 周内变成兰紫色。MTT 溶液呈黄色，在410 nm 波长处有最大吸收峰，随波长增大吸收值很快下降，至500 nm处趋于最低值。MTT由酶裂解生成Formazan。Formazan 不溶于水性溶剂，易溶于有机溶剂。乙醇，丙醇，异丙醇，乙二醇甲醚，DMSO 等都是比较好的溶剂，Formazan 的有机溶液呈兰紫色。细胞增殖实验通常在聚苯乙烯培养板上进行，四氯化碳、10 %SDS 和二氧六环对培养板有溶蚀性，不宜使用。
DMSO 和SDS 对Formazan 也有较好的溶解性，但凝固点太高，10 ℃以下不能用；丁醇等长碳链醇溶解Formazan 后与水相不混溶，呈分层液，不适合作Formazan溶剂。