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（4）放射免疫测定

放射免疫测定是用放射性同位素标记抗原或抗体，以检测相应抗原或抗体的定量方法。在筛选和鉴定单抗时常用抗原固相法，即用抗原包被聚乙烯微板，借以检测样品中的McAb，其操作步骤如下：

a、用碳酸盐缓冲液将抗原稀释至适宜的浓度（1-100ug/ml），滴加聚乙烯微板孔内，100ul/孔，4℃过夜或37℃ 2小时。

b、弃去抗原液，每孔加100ul含0.5-1% BSA的PBS，4℃ 1-2小时封闭。

c、用BSA-PBS洗涤3次，每次3分钟。

d、加待检样品，每孔100ul，设立阴性孔、阳性孔和空白孔；37℃1-2小时，同法洗涤。

e、每孔加125I标记的抗鼠Ig抗体工作液100ul，37℃ 1-2小时，同法洗涤。

f、用γ-射线闪烁计数仪分别测定各孔放射性。通常要求样品孔和阳性对照孔的放射性脉冲分别超过本底5倍和10倍。若以空白孔的放射性为基准，凡样品孔与阴性孔放射性之比大于3的样品定为阳性。

4、杂交瘤细胞的克隆化

从原始孔中得到的阳性杂交瘤细胞，可能来源于二个或多个杂交瘤细胞，因此它们所分泌的抗体是不同质的。为了得到完全同质的单克隆抗体，必须对杂交瘤细胞进 行克隆化。另一方面，杂交瘤细胞培养的初期是不稳定的，有的细胞丢失部分染色体，可能丧失产生抗体的能力。为了除去这部分已不再分泌抗体的细胞，得到分泌 抗体稳定的单克隆杂交瘤细胞系（又称亚克隆），也需要克隆化。另外，长期液氮冻存的杂交瘤细胞，复苏后其分泌抗体的功能仍有可能丢失，因此也应作克隆化， 以检测抗体分泌情况。通常在得到针对预定抗原的杂交瘤以后需连续进行2-3次克隆化，有时还需进行多次。所谓克隆化是指使单个细胞无性繁殖而获得该细胞团 体的整个培养过程。克隆化的方法很多，如有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪（FACS）分离法。这 里介绍最简单也是使用最广泛的前两种方法。

（1） 有限稀释法

材料：

a、96孔细胞培养板等；

b、HT培养基；

c、活力强的杂交瘤细胞；

d、小鼠腹腔细胞。

方法：

a、制备小鼠腹腔细胞。同“细胞融合”一节中的方法。

b、制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20%血清的HT培养基稀释至每毫升含2.5、15和50个细胞3中不同的稀释度。

c、按每毫升加入5×10⁴-1×10⁵细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞。

d、每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为0.2ml，每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10。

e、37℃、7.5% CO2湿润培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。

f、取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。

g、本法中（b）、（c）、（d）也可简化为将计数后的杂交瘤细胞准确地进行系列稀释，直至每毫升含10个细胞，按每孔接种0.1ml细胞悬液，即每孔含1个细胞。

（2）软琼脂法

材料：

a、HT培养基（双倍浓度）。

b、用0.15mol/L NaCl配制的2.0%琼脂糖：称取2.0g细胞培养用琼脂糖，悬浮于100ml 0.15mol/L NaCl，121℃高压灭菌15分钟，分装10ml小瓶，冷却后4℃保存。

c、小鼠腹腔细胞。

d、灭菌平皿。

e、45℃水浴。

f、活力很好的杂交瘤细胞。