无扩增产物
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反应成分问题：
| 可能的原因 | 解决办法 |
| 设计的引物不够好 | 1. 查找与本序列相关的文献所设计的引物 2. 确保引物内和引物间不存在互补 3. 增加引物长度 |
| 引物特异性不够 | 确保引物同靶序列完全互补 |
| 引物浓度不够 | 引物浓度可在0.05-0.1-0.2-0.5-1uM范围内按0.1uM的变化量优化 |
| 漏加试剂 | 扩增阳性对照以确定试剂没有漏加，重新配制反应混合物 |
| 试剂过期或储存不当或浓度不对 | 扩增阳性对照以确定试剂没有问题：例如新合成的引物可能有问题 |
| dNTP降解 | dNTP对反复冻融很敏感。将dNTP分成小份冰冻保存，迅速融化并立即置于冰上；避免反复冻融 |
| 引物降解 | 重新订购引物 |
| 模板质量不够好、降解 | 1. 使用更多的模板 2. 通过凝胶电泳分析DNA片段的完整性 3. 当扩增较长的产物时，确保模板没有降解 使用新分离的模板 |
| 模板浓度太低 | 1. 通过电泳检查模板浓度 2. 增加模板浓度 |
| 存在反应抑制物; 反应管污染抑制物 | 1. 通过乙醇沉淀或使用清洁试剂盒进一步纯化模板 2. 降低加入的模板量，或将模板用10mM Tris-HCl (pH8.0)稀释5倍后使用，或加入BSA 3. 使用新的反应管、将管子高压灭菌后使用 |
| 模板复杂 | 按1％的变化量添加DMSO、增加预变性温度和时间 |
| 靶DNA上不存在引物结合的靶点 | 换用其它来源的靶DNA |
| 反应缓冲液的pH过高 | |
| 缓冲液没有稀释 | 增加水 |
反应条件问题：
| 可能的原因 Possible Cause | 解决办法Solution |
| 变性温度过高或过低 | 按1℃的变化量调节温度 |
| 变性时间太长或太短 | 按5秒的变化量调节温度 |
| 退火温度过高 | 1. 使用可靠的方法重新计算引物的Tm值 2. 按2℃的变化量降低退火温度，退火温度起点设在比两引物的最低Tm值低5℃ |
| 循环数太少 | 按3-5个循环的变化量增加循环数 |
| PCR程序设定不正确 | 检查程序，确保时间和温度正确 |
| 样品台温度不一致，一些位置的温度过低 | 检查校准样品台加热能力。使用阳性对照来确定某些位置的产率过低 |
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