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冻存细胞的复苏

非玻璃化冻存的复苏方法  

主要材料

（1）仪器设备：恒温水浴箱、高速离心机；

（2）培养用液：完全培养液。

复苏过程

（1）调配37℃～40℃的温水，或将恒温水浴箱的温度调节至37℃～40℃；

（2）从液氮中取出冻存管，立即投入37℃～40℃ 温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解；

（3）将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5ml培养液，轻轻吹打混匀；

（4）将细胞悬液经800～1000r/min离心5min，弃上清夜；

（5）向细胞沉淀内加入完全培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足培养液进行培养。

结果

复苏后的细胞应该保持其冻存时的活力，活细胞数达90%以上。

讨论

细胞冻存悬液一旦融解后，要尽快离心除去冷冻保护液，防止冷冻保护剂对细胞产生毒性。实验人员在复苏细胞过程中，同样应具有自我保护意识，避免被液氮冻伤。

玻璃化冻存的复苏方法

以下以人的单核细胞为例说明其过程（Takhashi et al. 1986）。

主要材料

（1）设备：高速离心机；

（2）培养用液：添加20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液、培养液。

操作过程

（1）将冻存管从液氮中取出，立即投入冰浴中5min。复温速率约5600C/min。一次可以进行多个冻存管的复苏；

（2）将冻存管两端剪断，可以将5ml细胞冻存悬液转移到50ml离心管中；

（3）沿离心管壁缓慢加入已在冰浴中预冷的含20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液。前10min以0.2ml/min的速度加入，后10min以0.5ml/min的速度加入，接着的15min以0.75ml/min的速度加入，最后30min以1ml/min的速度加入。全过程约为65min，都在冰浴中进行；

（4）将稀释后的细胞悬液以400r/min离心5min，去除上清。向细胞沉淀中加入培养液重新悬浮细胞，用于培养。

结果

复苏后的细胞应该保存其冻存时的活力，活细胞数达90%以上。

讨论

复苏时，冷冻保护液的稀释及去除过程与冻存前冷冻保护液的滴加过程一样，不能在室温下而必须在40C冰浴中进行，避免在室温下冷冻保护剂对细胞产生毒性。稀释过程也要缓慢进行，保证有足够的时间让冷冻保护剂从细胞内渗出，以达到细胞内外的平衡，避免高渗透压的损伤。