程颖：循环细胞在小细胞肺癌临床研究中的进展
循环肿瘤细胞( Circulating tumor cells，CTCs)作为一种可替代原发肿瘤的“液体活检标本”，已在转移性乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌中用于预后评价。小细胞肺癌(Small celllung cancer，SCLC)肿瘤组织标本来源不足，且缺乏有效的监测复发转移和预测预后的生物标志物。近年来研究者CTCs在SCLC中的临床应用进行了探索性研究，发现CTCs对SCLC的诊断、分期，监测复发、转移，评估疗效、预后以及建立个体化治疗方案等具有重要意义，本文就CTCs在SCLC临床应用中的研究进展予以综述。
一、SCLC患者CTCs的检测方法
CTCs的检测方法主要有流式细胞检测技术( fluocytometry，FCM)、逆转录一聚合酶链反应(reverse-transcriptionPCR，RT-PCR)、CellSearch系统、CTC芯片(CTC-chip)技术和膜滤过分离肿瘤细胞技术(isolation by size of epithelial tumor cells．ISET)等，其中CellSearch系统因其半自动化的操作平台，较高的特异性、敏感性和可重复性，成为最常应用的CTCs检测方法。
早在2004年，Allard等率先应用CelISearch法检测了99例肺癌（未列举SCLC例数）患者的CTCs，随后Nagrath等采用CTC-chip法检测了55例肺癌患者外周血C TCs。2009年以后的研究多采用CeIISearch法检测SCI．C患者外周血CTCs，然而该方法由于对缺乏上皮细胞特征的肿瘤细胞会出现漏检可能，且与免疫磁珠及抗体结合的CTCs无法行某些后续的检测，临床应用受到局限。
近年来，随着纳米科技的发展，靶向CTCs表面标志物的特异性识别分f修饰的纳米材料结合微流控技术的CTCs检测平台的研究受到广泛关注，2013年，《自然》（Nature）杂志将CTCs纳米检测选为最具创新性和转化潜力的肿瘤诊断新方法，成果令人瞩目。但就目前来看，现有的CTCs检测方法各有利弊，未有研究证实哪种方法对SCLC的CTCs检测更有优势。着眼未来，亟需开发特异性、敏感性更高的CTCs检测技术，为SCLC的基础和临床研究带来突破。
二、CTCs在SCLC临床应用中的研究现状
（一）CTCs计数与SCLC的诊断、分期
近年来多项研究显示CTCs计数水平与SCLC的诊断、分期有密切关系0 2009年Tanaka等应用CeIISearch法检测了1 50例7.5ml外周血CTCs，其中肺癌1 25例、非恶性肿瘤25例，肺癌患者包括116例非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和9例SCLC。
研究结果显示SCLC患者CTCs阳性率为66.70-/0（6例／9例），明显高于NSCLC患者的CTCs阳性率(腺癌25.9%，鳞癌40.9%；腺癌对比SCLC，P<0.05)，提示SCLC患者CTCs水平高于NSCLC患者o Wu等应用免疫荧光染色法检测了47例肺癌患者7.5ml外周血的CTCs水平，其中包括34例NSCLC患者和1 3例SCLC患者c结果显示Ⅲ期SCLC患者CTCs≥2的检出率为600-/0（3例／5例），而Ⅳ期SCLC患者CTCs≥2的检出率为71%（5例／7例），提示CTCs计教水平与SCLC患者的分期有关。
同年，Hou等应用CeIISearch法检测了50例初治的SCLC患者外周血CTCs，包括20例局限期SCLC (limited disease，LD-SCLC)患者和30例广泛期SCLC(extensive disease，ED-SCLC)患者，基线期ED-SCLC及LD-SCLC患者的中位CTCs计数分别为237和2个/7.5ml血，7例未检出CTCs的患者均为LD-SCLC，证明CTCs计数水平与SCLC分期相关。
相似的结论在2012年被日本学者Naito等证实，研究者在51例SCLC患者中立用CeIISearch法检测基线期CTCs水平，结果显示ED-SCLC,患者的中位CTCs计数为9.5个f 7.5ml血，而LD-SCLC仅为1个／7.51111血，进一步证明ED-SCLC患者的CTCs水平高于LD-SCLC患者。
（二）CTCs评估SCLC的疗效及预后
CTCs是否可作为评估SCLC疗效和预后的有救指f,匙研究者们一直在探讨的问题。Houi等在2009年通过CellSearch法检测了50例SCLC患者(LD-SCLC20例，ED-SCLC30例)的CTCs，发现CTCs>300个/7.5ml血的患者及CTCs<2个/7.5ml血的患者中位生存期分别为134和443天（p<0.005），提示CTCs水平与患者的预后相关，CTCs水平高的患者预后差，经过1周期的化疗后，患者CTCs水平降低，提示CTCs可作为潜在的能反应化疗疗效的生物标志物。随后在2012年，研究者扩大了患者例数，通过检测97例SCLC患者的CTCs,经统计学分析确定了50个/7.5ml血的CTCs计数水平为SCLC患者的预后界定值（cutoff value）。
基线期CTCs>=50和<50个/7.5ml血的两组SCLC患者中位生存期（medianprogression-free survial, mPFS）分别为4.6和11.5个月、1年生存率分别为4.9%和21.4%，差异均具有统计学意义，证实基线期CTCs水平是SCLC独立预后因子，进一步分析显示1周期化疗后CTSs计数不能降低至50个/7.5ml血以下的患者预后不良，mOS仅2为4.1个月，而Naito等研究结果不同于Hou等确定的预后界定值。
在该研究中SCLC患者的预后界定值设定8个/7.5ml血，以此将患者分为CTCs>=8及<8个/7.5ml血，结果显示基线期两组mOS分别为8.5和17.2个月（p=0.0014），治疗结束后两组中位生存期分别为4.1和13.9个月（p=0.0096），复发后两组中位生存期分别为4.0和11.8个月（p<0.0001）。
Hiltermann等在2012年同样应用CellSearch法检测59例SCLC患者在基线期、1周期化疗后及4周期化疗结束后外固血CTCs水平，其中ED-SCLC患者38例，LD-SCLC患者2 1例c基线期有43例患者(730-/o)CTCs≥2个/7.5ml血，CTCs>215个/7.5ml血和CTCs<2个/7.5ml血的患者mOS分别为1 57和729天(P≤0.001)；
经过1周期化疗后患者CTCs水平明显降低，且1周期化疗后CTCs<2殁≥2个/7.5ml血的患者，两组PFS分别为10.7和2.9个月(P≤0.001)、OS分别为12.3和8.1个月(P≤0.001);4周期化疗后两组的PFS为7.9和3.9个月（P=0.007）、OS为12.3和8.1个月(P=0.05)。
研究者推断CTCs水平是SCLC预后的独立影响因子，其中1周期化疗后CTCs水平是SCLC疗效和预后最强的预测因子。
2013年ASCO发表的ECOG1508研究中，研究者尝试在155例ED-SCLC中加入靶向治疗，并对其中123例患者基线期CTCs进行检测，结果显示靶向治疗未能延长ED-SCLC患者的PFS和OS，但发现基线期CTCs≤l00和CTCs>100个／7.5ml血的mPFS分别为4.4和4.3个月（P=0.07），OS分别为10.7和7.2个月(P=0.01)。研究者认为虽然靶向治疗没能提高ED-SCLC患者的PFS和OS，但却发现了CTCs可能是SCLC患者的预后标志物。
最近，Igawa等尝试应用OBP-401试验检测SCLC患者外周血CTCso应用OBP-401试验检测乳腺癌和胃癌患者CTCs的相关研究已有前期报道。研究纳入30例韧治的SCLC患者，29例患者(96%)外周血CTCs阳性。在基线期，21例患者CTCs<2个/7.5ml血，其余8例患者CTCs≥2个/7.5ml血，两组mOS分别为14.8 vs.3.9个月(P=0.007)，提示基线期CTCs水平是SCLC独立的预后影响因子。经2周期化疗或放化疗后，对治疗呈部分缓解(PR)的19例患者中CTCs<2和CTCs≥2个/7.5ml患者的mPFS分别为8.3 vs.3.8个月(P=0.007)该研究首次应用OBP-401试验的方法检测SCLC患者，进一步证实CTCs为SCLC独立的预后因子。
（三）CTCs监测SCLC的复发和转移
现有的研究表明通过检测CTCs的出现来监测SCLC的复发和转移具有重要的临床意义o Tanaka等研究发现CTCs水平‘j 125例肺癌患者（包括9例SCLC患者）进展明显相关，特别是与远处转移密切（AUC-ROC 0,873 p<0.001）。发生远处黄钻一的肺癌患者CTCs计数显著高于无远处转移者，因此对那些CTCs阳性的的可疑患者和已确诊得为肺癌的患者，研究者已经推荐行PRT-CT或头胸部CT等检查以排除是否发生了远处转移。
基于这些数据，作者认为CTCs可作为监测肺癌远处转移的生物标记物。Natio等研究发现SCLC在基线期、治疗结束后及复发后CTCs的阳性率分别为68.6%、26.5%和67.6，提示SCLC复发后外周学CTCs水平升高，发生远处转移脏器的数目为0、1和>=2的患者其中位CTCs计数分别为2.0、7.5和21个/7.5ml血,提示CTCs水平与远处转移脏器的数目有关，远处转移越多，CTCs计数越高（p<0.00001）。发生肝转移的患者CTCs水平明显高于未发生肝转移者（p=0.0007）。
三、CTCs在SCLC临床应用中的探索方向
复发和转移是导致肿瘤患者治疗失败和死亡的主要原因，及时发现肿瘤的复发和转移并采敢积极有效的治疗措施可显著提高患者生存率。然而，由于SCLC缺乏能够监测肿瘤复发和转移的生物标志物，且常规影像学检查无法发现肿瘤微转移灶及微小残留病灶，导致发生复发和转移的SCLC患者不能及时接受诊断和治疗。
临床中部分LD-SCLC的患者预后差异较大，提示有些局限期的患者在诊断时可能已发生了影像学不能发现的微转移而成为潜在的广泛期患者。通过检测外周血CTCs的出现及数目变化从而对SCLC患者体内肿瘤状态进行实时、动态地跟踪监测和评价，及时发现肿瘤的复发、转移，将有助于临床医生对治疗时机的把握和治疗策略的选择，但究竟CTCs的数目或变化值为多少时能够精确反映SCLC的复发或转移尚不明确，需要更多的循证医学证据予以支持。
CTCs在评估SCLC患者治疗疗效方面的应用尚处于探索阶段，治疗过程中CTCs数目的变化与SCLC患者化疗疗效的相关性及其与SCLC患者放疗时机的选择等问题在未来需大量的临床研究。近5年，对CTCs是否可作为SCLC患者预后指标的研究逐渐增多，但SCLC最佳的预后CTCs界定值尚无定论，争议颇多。
其中3项来自Hou、Naito、Hiltermann的研究将SCLC的预后CTCs畀定值分别设定为50、8和2个／7.5ml血，差异很大，这可能与研究采用的统计学方法不尽相同以及入组样本量较少有关。近期意大利学者Normanno等主张将ED-SCLC和LD-SCLC患者分开研究，对基线期、l周期化疗后CTCs以及治疗前后CTCs的变化值分别设定预后界定值，为未来的研究提供了新的思路。笔者所在的科研团队也正致力于我国SCLC患者预后最佳CTCs界定值的研究，结果令人期待。
肿瘤的个体化治疗是肿瘤治疗模式的发展方向。SCLC患者对化疗药物的反应存在明显的个体差异，其主要原因可能与复杂的肿瘤异质性、基因表达差异及多态性有关。所以，逐步明晰SCLC的基因组学特征对实现真正意义上的SCLC个体化治疗尤为重要。近期我国学者王洁等研究人员通过应用单细胞基因测序手段对肿瘤患者单个CTC进行全基因组、外显子基因组测序。
在此项研究中，谢晓亮教授发明的多重退火和环化循环的扩增技术(MAIBAC)，成功实现了对肿瘤患者外周血单个CTC的全基因组扩增和深度测序，在单个细胞水平探测全基因组基因拷贝数变异(CNVs)和单核苷酸变异(SNVs)o单细胞水平CTCs基因组测序技术可及时提供如耐药基因突变等个体化治疗所需的重要信息，同时也为未来SCLC靶向药物的开发提供技术支持。
SCLC肿瘤组织标本难以获取，限制了后续各项检查和研究的开展，而利用CTCs构建的SCLC循环肿瘤细胞移植瘤( CTC-derived explants，CDXs)模型，有望解决这一棘手难题。最近，Hodgkinson等尝试将6例ED-SCLC患者lOml外周血中的CTCs提取后注射到免疫缺陷小鼠皮下，结果在4只小鼠身上形成了CDXs，证明SCLC患者的CTCs具有致瘤性。
同时应用CelISearch法检测这6例SCLC患者的CTCs，结果显示成功形成CDXs的4例患者的CTCs计数均>400个／7.5ml血，而另外2例未形成CDXs的患者其CTCs计数分别为222和20个／7.5ml血，提示SCLC的CTCs致瘤性与外周血CTCs教量有关。进一步分析发现相较于化疗敏感性SCLC，化疗耐药性SCLC患者的CDXs倍增时间短、生长更迅速。对3例CDXs给予顺铂和依托泊苷化疗药物，其敏感性顺序为CDX3>CDX2>CDX4，相应患者的OS分别为9.7.3.5.0.9个月，提示对CDXs进行体外药敏试验可以间接反应患者生存时间。
该研究显示部分SCLC的外周血CTCs具有干细胞特性，可进行体外培养、形成与原发肿瘤高度相似的CDXs，为SCLC患者的体外药敏试验、耐药机制分析等一系列检查和研究提供了足量的肿瘤组织，解决了SCLC患者肿瘤标本来源不足的问题。
结论
从现行的研究可以看出，虽然CTCs在SCLC中的临床应用仍处于探索阶段，但前景广阔。目前，诸多转化性研究正在进行中，相信随着研究的不断深入，CTCs有望成为SCLC的突破口，期待CTCs在SCLC的领域中为我们带来惊喜。
