实时荧光定量 PCR

所谓实时荧光定量 PCR 技术，是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

实验步骤  

一、 样品 RNA 的抽提

1.  取冻存已裂解的细胞，室温放置 5 分钟使其完全溶解。

2.  两相分离 每 1 ml 的 TRIZOL 试剂裂解的样品中加入 0.2 ml 的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体 15 秒后，15 到 30℃ 孵育 2 到 3 分钟。4℃ 下 12 000 rpm 离心 15 分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA 全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的 TRIZOL 试剂的 60%.

3.  RNA 沉淀 将水相上层转移到一干净无 RNA 酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的 RNA，混匀后 15 到 30℃ 孵育 10 分钟后，于 4℃ 下 12 000 rpm 离心 10 分钟。此时离心前不可见的 RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

4.  RNA 清洗 移去上清液，每 1 mlTRIZOL 试剂裂解的样品中加入至少 1 ml 的 75% 乙醇（75% 乙醇用 DEPCH2O 配制），清洗 RNA 沉淀。混匀后，4 ℃ 下 7 000 rpm 离心 5 分钟。

5.  RNA 干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使 RNA 沉淀在室温空气中干燥 5-10 分钟。

6.  溶解 RNA 沉淀 溶解 RNA 时，先加入无 RNA 酶的水 40μl 用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的 RNA 溶液保存于-80℃ 待用。

二、 RNA 质量检测

1.  紫外吸收法测定

先用稀释用的 TE 溶液将分光光度计调零。然后取少量 RNA 溶液用 TE 稀释（1:100）后，读取其在分光光度计 260 nm 和 280nm 处的吸收值，测定 RNA 溶液 浓度和纯度。

（1）浓度测定

A260 下读值为 1 表示 40 μg RNA/ml。样品 RNA 浓度（μg/ml）计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：

RNA 溶于 40 μl DEPC 水中，取 5 μl，1:100 稀释至 495 μl 的 TE 中，测得 A260 = 0.21RNA 浓度 = 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl 取 5 ul 用来测量以后，剩余样品 RNA 为 35 μl，剩余 RNA 总量为：

35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

（2）纯度检测

RNA 溶液的 A260/A280 的比值即为 RNA 纯度，比值范围 1.8 到 2.1。

2.  变性琼脂糖凝胶电泳测定

（1）制胶

1 g 琼脂糖溶于 72 ml 水中，冷却至 60℃，10 ml 的 10× MOPS 电泳缓冲液和 18 ml 的 37% 甲醛溶液（12.3 M）。

10×MOPS 电泳缓冲液

浓度  成分

0.4 M  MOPS,pH 7.0

0.1 M  乙酸钠

0.01 M  EDTA

灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入 25 μl 溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的 1×MOPS 电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

（2）准备 RNA 样品

取 3 μgRNA, 加 3 倍体积的甲醛上样染液，加 EB 于甲醛上样染液中至终浓度为 10 μg/ml. 加热至 70℃ 孵育 15 分钟使样品变性。

（3）电泳

上样前凝胶须预电泳 5 min, 随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm 电压下 2 h, 电泳至溴酚兰指示剂进胶至少 2-3 cm.

（4）紫外透射光下观察并拍照

28S 和 18S 核糖体 RNA 的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提 RNA 的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的 2 倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的 RNA（tRNA 和 5S 核糖体 RNA）组成。在 18S 和 28S 核糖体带之间可以看到一片弥散的 EB 染色物质，可能是由 mRNA 和其它异型 RNA 组成。RNA 制备过程中如果出现 DNA 污染，将会在 28S 核糖体 RNA 带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA 的降解表现为核糖体 RNA 带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

三、样品 cDNA 合成

1.  反应体系                                                                                                                                                          

轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm 短暂离心。

2.  混合液在加入逆转录酶 MMLV 之前先 70℃ 干浴 3 分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶 0.5 μl,37℃ 水浴 60 分钟。

3.  取出后立即 95℃ 干浴 3 分钟，得到逆转录终溶液即为 cDNA 溶液，保存于-80℃ 待用。

四、 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量 PCR

1.  β-actin 阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为 1011，反应前取 3 μl 按 10 倍稀释（加水 27 μl 并充分混匀）为 1010, 依次稀释至 109、108、107、106、105、104, 以备用。

2.  反应体系如下：

标准品反应体系                                                                                                                                                     

轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm 短暂离心。

3.  管家基因反应体系：                                        

轻弹管底将溶液混合， 6000 rpm 短暂离心。

3.  制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃　2 分钟，然后 93℃ 1 分钟，55℃ 2 分钟，共 40 个循环。

五、 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的 DNA 模板

1.  针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的 cDNA 模板进行 PCR 反应。

2.  反应体系                                                                                  

轻弹管底将溶液混合，6000rpm 短暂离心。

35 个 PCR 循环（94℃ 1 分钟；55℃ 1 分钟；72℃ 1 分钟）； 72℃ 延伸 5 分钟。

（3）PCR 产物与 DNA Ladder 在 2% 琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测 PCR 产物是否为单一特异性扩增条带。

（4）将 PCR 产物进行 10 倍梯度稀释： 将 PCR 产物进行 10 倍梯度稀释： 设定 PCR 产物浓度为 1×10¹⁰，依次稀释至 10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴ 几个浓度梯度。

六、 待测样品的待测基因实时定量 PCR

1.  所有 cDNA 样品分别配置实时定量 PCR 反应体系。

2.  体系配置如下                                                                                

轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm 短暂离心。

（3）将配制好的 PCR 反应溶液置于 Realtime PCR 仪上进行 PCR 扩增反应。反应条件为：93℃ 2 分钟预变性，然后按 93℃ 1 分钟，55℃1 分钟，72℃1 分钟，共 40 做个循环，最后 72℃7 分钟延伸。

七、 实时定量 PCR 使用引物列表

引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发 DNA 聚合反应（即错配）。

八、电泳

各样品的目的基因和管家基因分别进行 Realtime PCR 反应。PCR 产物与 DNA Ladder 在 2% 琼脂糖凝胶电泳，GoldView 染色，检测 PCR 产物是否为单一特异性扩增条带。

编辑： qimx    来源：丁香园