凝胶迁移实验

凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）可以：

（1）研究 DNA 结合蛋白和其相关的 DNA 结合序列相互作用；

（2）可用于 DNA 定性和定量分析；

（3）用于研究 RNA 结合蛋白和特定的 RNA 序列的相互作用。

一、探针的标记

1.   如下设置探针标记的反应体系：

（1）待标记探针（1.75 pmol/微升）:2 微升。

（2）T4 Polynucleotide Kinase Buffer（10X）:1 微升。

（3）Nuclease-Free Water :5 微升。

（4）[γ-32P]ATP（3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml）:1 微升。

（5）T4 Polynucleotide Kinase（5-10 u/微升）:1 微升。

（6）总体积 10 微升

（7）按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex 混匀，再加入 T4 Polynucleotide Kinase，混匀。

2.   使用水浴或 PCR 仪，37 ℃ 反应 10 分钟。

3.   加入 1 微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。

4.   再加入 89 微升 TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在 30% 以上，即总放射性的 30% 以上标 记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。

5.  标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过 3 天。标记好的探针可以保存在-20℃。

二、 探针的纯化

通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善 EMSA 的电泳结果。如需纯化，可以按照如 下步骤操作：

1.  对于 100 微升标记好的探针，加入 1/4 体积即 25 微升的 5 M 醋酸铵，再加入 2 体积即 200 微升的无水乙醇，混匀。

2.   在-70 ℃ 至-80 ℃ 沉淀 1 小时，或在-20 ℃ 沉淀过夜。

3.  在 4 ℃，12 000 g-16 000 g 离心 30 分钟。小心去除上清，切不可触及沉。

4.   在 4 ℃，12 000 g-16 000 g 离心 1 分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。

5.   加入 100 微升 TE， 完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过 3 天。标记好的探针可以保存在 -20 ℃。

三、EMSA 胶的配制

1.   准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。

2.   按照如下配方配制 20 毫升 4% 的聚丙烯酰胺凝胶（注意：使用 29:1 等不同比例的 Acr/Bis 对结果影响不大）。

（1）TBE buffer（10X）： 1 毫升。

重蒸水 16.2 毫升。

（2）39:1 acrylamide/bisacrylamide（40%,w/v）： 2 毫升。

（3）80% 甘油： 625 微升。

（4）10% 过硫酸铵（ammonium persulfate）:150 微升。

（5）TEMED :10 微升

3.  按照上述次序加入各个溶液，加入 TEMED 前先混匀，加入 TEMED 后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡， 并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。

四、EMSA 结合反应

1.   如下设置 EMSA 结合反应

阴性对照反应：

（1）Nuclease-Free Water :7 微升。

（2）EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液（5X）:2 微升。

（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 0 微升。

（4）标记好的探针 :1 微升。

（5）总体积 :10 微升。

样品反应：

（1）Nuclease-Free Water :5 微升。

（2）EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液（5X）:2 微升。

（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子 :2 微升。

（4）标记好的探针： 1 微升。

（5）总体积： 10 微升。

探针冷竞争反应：

（1）Nuclease-Free Water :4 微升。

（2）EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液（5X）:2 微升。

（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 2 微升。

（4）未标记的探针： 1 微升。

（5）标记好的探针： 1 微升。

（6）总体积 :10 微升。

突变探针的冷竞争反应：

（1）Nuclease-Free Water :4 微升。

（2）EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液（5X）:2 微升。

（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子 :2 微升。

（4）未标记的突变探针： 1 微升。

（5）标记好的探针： 1 微升。

（6）体积 :10 微升

uper-shift 反应：

（1）Nuclease-Free Water:4 微升。

（2）EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液（5X）:2 微升。

（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子：2 微升。

（4）目的蛋白特异抗体 :1 微升。

（5）标记好的探针：1 微升。

（6）总体积 :10 微升。

2.   按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温（20-25℃）放置 10 分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温（20-25℃）放置 20 分钟。

3.   加入 1 微升 EMSA/Gel-Shift 上样缓冲液（无色，10X），混匀后立即上样。注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和 DNA 的结合，建 议尽量使用无色的 EMSA/Gel-Shift 上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。

五、 电泳分析

1.  用 0.5XTBE 作为电泳液。按照 10V/厘米的电压预电泳 10 分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的 1X 的 EMSA 上样缓冲液（蓝色），以观察电压是否正常进行。

2.   把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入 10 微升稀释好的 1X 的 EMSA/Gel-Shift 上样缓冲液（蓝色），用于观察电泳进行的情况。

3.   按照 10 V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过 30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至 EMSA/Gel-Shift 上样缓 冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘 1/4 处，停止电泳。

4.   剪一片大小和 EMSA 胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有 EMSA 胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边 缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块（注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板），把滤纸从 EMSA 胶的一侧逐渐覆盖住整个 EMSA 胶，轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后（大约不足 1 分钟），轻轻揭起滤纸，这时 EMSA 胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平，在 EMSA 胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。

5.  干胶仪器上干燥 EMSA 胶。然后用 X 光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。

编辑： qimx    来源：丁香园