免疫共沉淀（Co-IP）

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）可以：

（1）测定两种目标蛋白质是否在体内结合；

（2）确定一种特定蛋白质的新的作用搭档；

（3）分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

实验步骤：

一、试剂准备

1.  预冷 PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机。

2.  用预冷的 PBS 洗涤细胞两次，最后一次吸干 PBS.

3.  加入预冷的 RIPA Buffer（1 ml/10⁷ 个细胞、10 cm 培养皿或 150 cm² 培养瓶，0.5 ml/5×10⁶ 个细胞、6 cm 培养皿、75 cm² 培养瓶）。

4.  用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到 1.5 EP 管中，4 ℃，缓慢晃动 15 min（EP 管插冰上，置水平摇床上）。

5.  4 ℃，14000 g 离心 15 min，立即将上清转移到一个新的离心管中。

6.  准备 Protein A agarose，用 PBS 洗两遍珠子，然后用 PBS 配制成 50% 浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠。

7.   每 1 ml 总蛋白中加入 100 μl Protein A 琼脂糖珠（50%），4 ℃ 摇晃 10 min（EP 管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景。

8.   4 ℃，14000 g 离心 1 5 min，将上清转移到一个新的离心管中，去除 Protein A 珠子。

9.（Bradford 法）做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释 1:10 倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在 -20 ℃ 保存一个月）。

10.  用 PBS 将总蛋白稀释到约 1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如 10 μg/μl）。

11.  加入一定体积的兔抗到 500 μl 总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异。

12.  4 ℃ 缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温 2 h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用 2 h 室温孵育。

13.  加入 100 μl Protein A 琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4 ℃ 缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温 1 h, 如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加 2 μl「过渡抗体」（兔抗鼠 IgG，兔抗鸡 IgG）。

14.  14000 rpm 瞬时离心 5 s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的 RIPA buffer 洗 3 遍，800 μl/遍，RIPA buffer 有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用 PBS.

15.  用 60 μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl 足够上三道）。

16.  将上样样品煮 5 min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮 5 min 变性。

二、免疫共沉淀反应

1.  转染后 24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解 30 min，细胞裂解液于 4°C，最大转速离心 30 min 后取上清；

2. 取少量裂解液以备 Western blot 分析，剩余裂解液加 1 μg 相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C 缓慢摇晃孵育过夜；

3. 取 10 μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗 3 次，每次 3 000 rpm 离心 3 min；

4 将预处理过的 10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中 4°C 缓慢摇晃孵育 2-4 h, 使抗体与 protein A 琼脂糖珠偶连；

5. 免疫沉淀反应后，在 4°C 以 3,000 rpm 速度离心 3 min, 将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用 1 ml 裂解缓冲液洗 3-4 次；最后加入 15 μl 的 2×SDS 上样缓冲液，沸水煮 5 分钟；

6. SDS-PAGE，Western blotting 或质谱仪分析。

三、通过免疫共沉淀确定结合蛋白

1. 用磷酸盐缓冲液洗 30 块 10 cm 培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到 1 ml 冰冷的 EBC 裂解缓冲液中；

2. 将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上 4℃ 以最大速度离心 15 ;

3. 收集上清（约 30 ml）并加入 30 μg 的适当抗体，4℃ 摇动免疫沉淀物 1 h；

4. 加入 0.9 ml 的蛋白质 A-Sepharose 悬液，4℃ 摇动免疫沉淀物 30 min；

5. 用含 900 mmol/L NaCl 的 NETN 洗蛋白 A-Sepharose 混合物，再重复洗 5 次。最后，用 NETN 洗一次；

6. 吸出混合物的液体部分。加入 800 μl 的 1×SDS 胶加样缓冲液到球珠中，煮沸 4 min；

7. 将样品加入到大孔的不连续 SDS-PAGE 梯度胶中，在 10 mA 的恒定电流下电泳过夜；

8. 通过考马斯亮蓝染色观察蛋白质泳带；

9. 从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用 1 ml 50% 乙腈洗两次，每次 3 min；

10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱；

11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在 ABI 477A 或 494A 机器上进行自动 Edman 降解测序。

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编辑： qimx    来源：丁香园