染色质免疫共沉淀（ChIP）

染色质免疫共沉淀可以：

（1）组蛋白修饰酶的抗体作为「生物标记」；

（2）转录调控分析；

（3）药物开发研究；

（4）DNA 损失与凋亡分析。

实验步骤：

一、细胞的甲醛交联与超声破碎（ 第一天）

1.  取出 1 平皿细胞（10 cm 平皿），加入 243 ul 37% 甲醛，使得甲醛的终浓度为 1%（培养基共有 9 ml）。

2.  37℃ 孵育 10 min.

3.  终止交联：加甘氨酸至终浓度为 0.125 M。450 ul 2.5 M 甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置 5 min 即可。

4.  吸尽培养基，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 次。

5.  细胞刮刀收集细胞于 15 ml 离心管中（PBS 依次为 5 ml，3 ml 和 3 ml）。预冷后 2 000 rpm 5 min 收集细胞。

6.  倒去上清。按照细胞量，加入 SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每 200ul 含 2×10⁶ 个细胞。这样每 100 ul 溶液含 1×10⁶ 个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设 MCF7 长满板为 5×10⁶ 个细胞。本次细胞长得约为 80%。即为 4×10⁶ 个细胞。因此每管加入 400 ul SDS Lysis Buffer。 将 2 管混在一起，共 800 ul。

7.  超声破碎：VCX750，25% 功率，4.5 s 冲击，9 s 间隙。共 14 次。

二、除杂及抗体哺育（第一天）

1.  超声破碎结束后，10 000 g 4℃ 离心 10 min。去除不溶物质。

2.  留取 300ul 做实验，其余保存于-80℃。

3.  300 ul 中，100 ul 加抗体做为实验组；100 ul 不加抗体做为对照组；100 ul 加入 4 ul 5 M NaCl（NaCl 终浓度为 0.2 M），65℃ 处理 3 h 解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。

4.  在 100 ul 的超声破碎产物中，加入 900 ul ChIP DilutionBuffer 和 20 ul 的 50×PIC。

再各加入 60 ul ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA。4℃ 颠转混匀 1 h。

5.  1 h 后，在 4℃ 静置 10 min 沉淀，700 rpm 离心 1 min。

6.  取上清。各留取 20 ul 做为 input。一管中加入 1 ul 抗体，另一管中则不加抗体。4℃ 颠转过夜。

三、检验超声破碎的效果（第一天）

1.  取 100 ul 超声破碎后产物，加入 4 ul 5M NaCl,65℃ 处理 2 h 解交联。

2.  分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

四、免疫复合物的沉淀及清洗（第二天）

1.  孵育过夜后，每管中加入 60 ul ProteinA  Agarose/SalmonSperm DNA.4℃ 颠转 2 h。

2.  4℃ 静置 10 min 后，700 rpm 离心 1 min。除去上清。

3.  依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在 4℃ 颠转 10 min，4℃ 静置 10 min 沉淀，700 rpm 离心 1 min，除去上清。

洗涤溶液：

（1）low salt wash buffer-one wash

（2）highsalt wash buffer-one wash

（3）LiCl wash buffer-one wash

（4）TE buffer-two wash

4.  清洗完毕后，开始洗脱。

洗脱液的配方：100 ul 10%SDS，100 ul1M NaHCO3,800 ul ddH2O, 共 1 ml。

每管加入 250 ul 洗脱 buffer, 室温下颠转 15 min, 静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管 500 ul.

5.  解交联：每管中加入 20 ul 5M NaCl（NaCl 终浓度为 0.2 M）。

6.  混匀，65℃ 解交联过夜。

五、DNA 样品的回收（第三天）

1.  解交联结束后，每管加入 1 ul RNaseA（MBI），37℃ 孵育 1 h。

2.  每管加入 10 ul 0.5 M EDTA，20 ul1M Tris.HCl（PH6.5），2 ul 10 mg/ml 蛋白酶 K.45℃ 处理 2 h。

3.  DNA 片段的回收----omega 胶回收试剂盒。最终的样品溶于 100 ul dd H₂O。

六、PCR 分析 （第三天）

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编辑： qimx    来源：丁香园