QFT 常见问题：实验室专业人员版
以下是与 QuantiFERON-TB Gold (QFT®) 实验技术相关的一些常见问题及解答做为参考，检测步骤以及所有其它与应用或 实验性能相关问题以 QuantiFERON-TB Gold 说明书为准。
测试原理
QuantiFERON-TB Gold 实验是一种检测结核分枝杆菌感染的辅助体外诊断方法。该方法采用的专利技术：在人全血中检测 受结核分枝杆菌特异性抗原刺激 T 细胞所分泌的 γ- 干扰素含量。
QFT 实验方法简单易懂，它包括以下步骤：
● 采集血样至 QFT 血液培养管中
● 37ºC 下孵育 16～24 小时
● 以 ELISA 法检测收集的血浆中的 γ- 干扰素含量
● 利用 QFT 专业分析软件，分析和报告检测结果
血样采集
采血量没有达到 QFT 血液培养管的黑色标识线，这是否重要？
管上的黑色标记线提示收集的血量为 1 ml。QFT 血液培养管的血量在 0.8–1.2 ml 范围内是有效的。如果试管里的血量未 接近标识线，建议重新取样。
混匀过程有怎样的重要性？
抗原混匀步骤是为了确保刺激抗原均匀分布，以便白细胞摄取和处理抗原，然后呈递给 T 细胞，从而引起 IFN-γ 的分泌。在 QFT 实验中这是一个非常重要的步骤，混匀不当可造成结果错误。
为确保血液覆盖全管内壁并将管内壁上的抗原溶解，取血样后立即以合适的力度充分振摇试管 10 次。彻底混匀是将血样 与管壁内容物进行有效混合的必要操作。混匀过程可能会产生血液气泡，但这不会对检测性能带来不利影响。操作时应遵照常规的血液处理预防措施。应在 17–25ºC 的环境下采取血样。
关于血液处理步骤的技术说明可在 www.QuantiFERON.com查阅。
运输时血液培养管是否能平放？
可以，血液培养管可平放运输，但须在试管已被振摇后。在放入 37ºC±1ºC 的培养箱前，应再次将血液培养管颠倒 10 次 混匀。
37°C 孵育前血样应在什么的温度进行运输或存放？
血样应在室温（17～27ºC）存放和运输。血样不可冰冻或置于冰块中。
孵育血样 / 收集血浆
如果采血与 37ºC 孵育的时间间隔超过 16 小时会有什么影响？
若不是在采血后立即孵育的，在孵育前必须重新颠倒混匀试管 10 次。采血后超过 16 小时孵育时，由于细胞衰减（死亡），可能会减少 IFN-α 的产生量，导致敏感性和准确性下降。
孵育时血液培养管能平放吗？
不能，QFT 血液培养管在 37ºC 孵育时必须直立放置。
收集血浆前是否必须离心？
虽然未经离心也可以收集血浆，但推荐将试管离心，以便于收集血浆。另外要注意收集血浆时不要搅动血细胞。
血液培养管从培养箱取出后是不是必须立即离心？
在离心或收集血浆前，QFT 血液培养管可在 4–27ºC 存放最多 3 天。
离心时分离胶没有移动，该怎样处理？
37ºC 孵育后，在 2,000–3,000 RCF (g) 离心 15 分钟，血浆会和血细胞分离。分离胶应该移至可分隔血细胞和血浆的位置。如果这种情况没有发生，试管应以更高的转速再次离心。
离心后在收集血浆前，要避免上下反复吸液或其它任何混合血浆的操作。
● 血浆样本应只用一个移液器来吸取
● 血浆样本可直接从离心后的血液培养管加到 QFT ELISA 微孔板上， 包括使用全自动 ELISA 工作站时
● 血浆样本可在 2–8ºC 保存最多 28 天， 血浆吸出后在 –20ºC 以下可保存更长时间
血浆颜色和通常的有所不同，这是否可以？
从 QFT 血液培养管分离出的血浆显示比通常情况更红 —— 这是正常现象。要提醒的是，即使无任何红细胞污染，血浆也 会呈现从几乎无色到黄色 / 浅褐色等不同颜色。一些血浆甚至会出现不透明的外观。研究发现这些不同颜色不会影响 QFT 结果。
我需要在 II 级生物安全柜内收集血浆吗？
理想条件下，任何血样处理工作都应在安全柜内实施，这样可以将来自潜在感染血样的感染（如 HIV、乙肝等）风险降至最低。然而，如果使用无菌技术，是可以在生物安全柜外收集血浆。应遵守「实验室安全条例」，包括使用防护服饰，如手套、防护服、安全眼罩等，即相关规定要求的措施。
我需要从红细胞层或分离胶上面收集多少血浆？这是否重要？
因为 ELISA 试验仅需 50 μl 血浆，所以只要收集 100 μl 血浆足以用于检测。如要求比对（复查），200 μl 血浆是足够的。通常情况下收集到超过 300 μl 血浆是可能的。确定的研究表明 IFN-γ 是均匀分布在血浆里的，因此收集的血浆量不是关键的。收集到的血浆量会在不同病人间有所差异。QuantiFERON 试验也可以通过自动系统直接从血液培养管收集血浆。这种方式可以使收集血浆和 ELISA 试验的人工操作最少。
注意：无论手工或自动操作，在离心后、收集血浆前，不要上下反复吸取血浆或其他任何方式混合血浆。
我想批量检测从而使 QuantiFERON-TB Gold 试验的成本效率最大化。收集的血浆的稳定性如何？
收集的血浆（或离心后保存在血液培养管的血浆）能在 2–8ºC 的条件下保存多达 28 天，或在 –20ºC 下保存更长时间。血 浆保存在 –70ºC 下出现纤维凝块的可能性较小。如果仅是短期保存（少于 28 天），冷藏血浆样本比冷冻更好，因冷冻可能形成纤维凝块。
冷冻保存时血浆样本出现凝块应如何处理？
冷冻血浆融化后可能需要离心以沉淀在冷冻 / 融化过程中形成的凝块。试剂盒说明书有处理血浆样本凝块的指导概要。我是否要使用微管储存收集的血浆？在这种情况下我能否使用更有成本效率的微孔板？未包被的、低吸附性的微孔板可用于储存收集的血浆，但须覆盖合适的粘性覆盖物以防止血浆蒸发。
IFN-γELISA 操作
稳定性问题 :
● 标准品
复溶后的 IFN-γ 标准品溶液在 2–8ºC 可保存多达 3 个月（应记录复溶日期）。复溶后的标准品溶液使用之前须在室温 (17–27ºC) 平衡 1 小时。
● 100 倍浓缩结合物
复溶后，100 倍浓缩结合物可在 3 个月内使用，超过期限要丢弃。实验浓度的结合物（100 倍浓缩结合物与绿色稀释 液混合）须在配制后 6 小时内使用。不再使用的 100 倍浓缩结合物必须立即放回至 2–8ºC 的保存。
● 洗涤液
实验浓度的洗涤液在室温 (17–27ºC) 条件下可以保存多达 2 周。
QuantiFERON ELISA 板从冰箱里取出后能否立刻使用？
不能。打开箔衬袋前，密封的 ELISA 板应在室温平衡至少 1 个小时。
是否需要配置自动洗板机？
不需要。虽然我们推荐使用自动洗板机，但也可按照说明书步骤进行手工洗板。
QuantiFERON ELISA 操作中洗板的重要性如何？
像大多数 ELISA 实验一样，洗板不充分或不正确是导致 QuantiFERON ELISA 试验失败的一个最常见原因。如遇此类问题，
请参考下列解决措施
● 如果在洗的过程中有水泡或泡沫形成，可通过调节洗板注液量（通常是降低）而预防这种情况出现
● 将洗液量保持在可以达到每个孔的顶部水平（每孔顶部形成凸出的弧面为宜）
● 确保注进每个孔的洗液足够且等量，堵塞的洗板机针头按仪器说明书清洗
● 试剂说明书规定应至少洗板 6 次，但在不影响实验性能的前提下可以增加洗涤次数
● 建议两次洗板间的浸泡时间不应短于 5 秒
数据分析
阴性对照管数值太高是为什么？
大多数情况下，阴性对照管的 IFN-γ 浓度范围在 5 IU/ml 以下（不过到 8 IU/ml 的值也是可以接受的）。如果阴性对照管的 值远高于此，可能是由于技术上的差错。这种情况下，应判断是否需要重测。若要重测，建议将该个体所有血浆样本都重新检测。如果阴性对照管数值仍然很高，且不存在血浆样本污染的可能，那么阴性对照管的结果是有效的。一个良好的习惯是在每次实验后检查所有阴性对照管的值以确保结果符合或接近预期的范围。
病人的结核抗原管数值非常高（可能超出酶标仪的检测限），这是否有问题？
有时候病人的结核抗原管的 IFN-γ 值可能超出酶标仪的上限，但只要病人的阴性对照管数值不高 于 8 IU/ml，这种情况是不会影响检测结果的判读。
所测的 IFN-γ 数量与结核感染的阶段或程度是否相关联？
不相关。个体的结核抗原管 IFN-γ 数值减去阴性对照管数值 ≥ 0.35 IU/ml（同时 ≥ 25% 阴性对照管值），该个体有可能是 受到了结核分枝杆菌的感染。根据目前获得的数据，不能确定对结核抗原的反应水平与感染阶段或程度、免疫应答水平或进展成活动性结核病有相关性。
有没有简便的计算和判读 QuantiFERON-TB Gold 检测结果的方法？
试剂盒说明书里有数据分析和检测结果判读的概述性说明。可通过电子表格来计算 QuantiFERON 结果。或者，可使用 www.QuantiFERON.com 上的 QuantiFERON 分析软件来分析实验的原始数据并计算结果。QuantiFERON 分析软件可以直接从酶标仪分析软件（或任何电子表格）简单地导入原始数据。
QuantiFERON 分析软件功能包括：
● 计算标准曲线
● 标准品重复性和标准曲线的质量控制检查
● 根据标准曲线计算所有样本的 IFN-γ 含量 (IU/ml)
● 按照试剂盒说明书的「结果判读」规定报告每个患者的诊断结果
● 请确保您所使用的 QuantiFERON-TB Gold 软件是所在区域的最新版本
疑难解答
结果与预期值有差异，是什么原因引起的 ?
下表列出了 ELISA 的常见问题，包括可能的原因及相应的解决办法。
吸光度偏低
| 可能原因 | 解决办法 |
| 标准品稀释错误 | 确保试剂盒标准品的稀释按照说明书要求正确准备。 |
| 移液错误 | 确保移液器加入准确的量。 |
| 洗液稀释错误 | 确保按 1:19 的比例将浓缩洗液稀释成实验所需浓度的洗液。 |
| 孵育温度太低 | ELISA 孵育应在室温 17～27ºC 进行。 |
| 孵育时间太短 | 加有结合物、标准品和样本的微孔板应孵育 120±5 分钟，加酶底物溶液后再孵育 30 分钟。 |
| 酶标仪的滤光片使用错误 | 酶标板应用 450 nm 滤光片及 620～650 nm 参考滤光片读数。 |
| 试剂过冷 | 100 倍浓缩结合物以外的所有试剂，均应于检测前置于室温约 1 小时。 |
| 试剂盒 / 成分过期 | 确保试剂盒在有效期内使用。确保复溶的标准品及 100 倍浓缩结合物在复溶后 3 个月内使用。 |
标准品复测差异
| 可能原因 | 解决办法 |
| 混合不足 | 在加入酶标板前，通过倒置或温和涡旋充分混合试剂。 |
| 酶标板清洗不完全 | 每个微孔要用 400 μL 洗涤液清洗至少 6 次。根据使用的洗板机不同，有可能要求清洗超过 6 次。每次清洗间应该至少要有 5 秒钟的浸泡期。 |
| 不一致的移液操作或检测过程中断 | 加入样本和标准品应当连续进行。所有试剂都应在开始检测前准备好。 |
背景吸光度太高
| 可能原因 | 解决办法 |
| 酶标板清洗不完全 | 每个微孔要用 400 μL 洗涤液清洗至少 6 次。根据使用的洗板机不同，有可能要求清洗超过 6 次。每次清洗间应该至少要有 5 秒钟的浸泡期。 |
| 结合物复溶 / 稀释错误 | 用 300 μL 蒸馏水复溶 100 倍浓缩结合物。按试剂盒说明书所述，100 倍浓缩结合物和绿色稀释液以 1:100 比例稀释，配置成实验所需浓度的结合物。 |
| 孵育温度太高 | ELISA 的孵育温度为室温，即 17–27ºC。 |
| 试剂成分过期 | 确保复溶的标准品及 100 倍浓缩结合物在复溶后 3 个月内使用。 |
| 酶底物溶液被污染 | 如酶底物溶液呈现蓝色则不再使用。确保使用清洁的盛放试剂的凹槽。 |
| 吸取样本前混合离心过的血液培养管里的血浆 | 离心后在吸取血浆之前，要避免上下反复吸液和其它任何混合血浆的操作。始终注意不要触碰分离胶表面的物质。 血浆样本应只用一个移液器来吸取。 血浆样本可直接从离心后的血液培养管加入到 ELISA 板微孔中，包括使用自动 ELISA 工作站进行检测时。 血浆样本可于 2–8ºC 保存最多 28 天。血浆吸出后在 –20ºC 以下能保存更长时间。 |
标准曲线不佳
| 可能原因 | 解决办法 |
| 酶标板清洗不完全 | 每个微孔要用 400 μL 洗涤液清洗至少 6 次。根据使用的洗板机不同，有可能要求清洗超过 6 次。每次清洗间应该至少要有 5 秒钟的浸泡期。 |
| 标准品稀释错误 | 确保试剂盒标准品的稀释按照说明书要求正确准备。 |
非特异性的颜色产生
| 可能原因 | 解决办法 |
| 酶标板清洗不完全 | 每个微孔要用 400 μL 洗涤液清洗至少 6 次。根据使用的洗板机不同，有可能要求清洗超过 6 次。每次清洗间应该至少要有 5 秒钟的浸泡期。 |
| ELISA 微孔交叉污染 | 样品的吸取及混合时要小心，降低错误风险。 |
| 试剂盒成分过期 | 确保试剂盒在有效期内使用。确保复溶的标准品及 100 倍浓缩结合物在复溶后 3 个月内使用。 |
| 试剂盒成分被污染 | 避免试剂盒成分被污染。 |
| 吸取样本前混合离心过的血液培养管里的血浆 | 离心后在吸取血浆之前，要避免上下反复吸液和其它任何混合血浆的操作。始终注意不要触碰分离胶表面的物质。 血浆样本应只用一个移液器来吸取。 血浆样本可直接从离心后的血液培养管加入到 ELISA 板微孔中，包括使用自动 ELISA 工作站进行检测时。 血浆样本可于 2–8ºC 保存最多 28 天。血浆吸出后在 –20ºC 以下能保存更长时间。 |
QFT 已获欧洲 CE 认证，美国及中国 FDA 均已批准 QFT
美国 FDA 已批准 QFT 为检测结核分枝杆菌感染的体外诊断方法。它通过模拟 ESAT-6,CFP-10 和 TB7.7 蛋白的多肽混合物刺激肝素抗 凝的全血中的细胞。通过酶联免疫吸附检测 γ 干扰素浓度，在体外试验中确定对结核分枝杆菌感染相关的三种多肽抗原的应答反应。FDA 在批准函中指出：QFT 是结核分枝杆菌感染 ( 包括疾病 ) 的间接检测方法，可与危险因素评估、放射学检查和其它医学或诊断方法联合应用。多种语言版本的 QFT 试剂盒说明书，以及最新的许可信息和产品特别免责声明可在网站 www.QuantiFERON.com上查到。
Trademarks: QIAGEN®, QFT®, QuantiFERON®(QIAGEN Group).
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