Real-time PCR实验注意事项
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发布日期: 2006-12-16 15:11 文章来源: 丁香园
关键词: Real-time PCR 实验 注意事项 点击次数:

实验中的一些好习惯:

加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均;移液枪用完之后要归到最大计量的位置,防止久而久之弹簧失去弹性
一定要记着关水浴箱,切记切记;多和大家讨论,同时多关注别人讨论的经验,这几乎是最快提高的捷径了;所有的试剂都自己配,出了问题才好找原因。

防止RNA酶污染的措施:

1.   所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。

2.   塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。

3.   有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室温10min,然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干。

4.   配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC,在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

5.   操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。

6.   设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用。

常用的RNA酶抑制剂:

1.  焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。

2.  异硫氰酸胍:目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。

3.  氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。

4.  RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。

5.  其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

因为DEPc不加选择的修饰蛋白质和RNA,因此在分离和纯化RNA过程中不能使用,而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容
在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。

RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。

研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此进行RNA实验时应勤换手套。

但DEPC能与胺和巯基反应,因而 含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理

动植物总RNA提取-Trizol法:

Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑点分析,斑点杂交, Poly(A)+分离,体外翻译,RNase封阻分析和分子克隆。

1.  将组织在液N中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。

2.  研磨液室温放置5分钟,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。

3.  取上层水相于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟。

4.  弃去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4℃下7500g离心5分钟。

5.  小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中,必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

[注意]

1.  整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作。
另外,提取上清这步一定要小心,靠近沉淀的部分一定要舍得不要,要不然会有蛋白质污染,影响比值

2.  加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年。

总mRNA的提取(自己的经验):

一、  关于Trizol Reagent需要的试剂

1.  Chloroform:氯仿(分析纯)

2.  Isoproplyl alcohol:异丙醇(分析纯)

3.  75% Ethanol(in DEPC-treated water):75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。

4.  RNase-free water:无Rnase的水。方法是:将DEPC按0.01%(V/V)加在d H2O中500ml(50ul),在37℃过夜,并高压灭菌即得(150℃ 3小时)

5.  一次性塑料手套

6.  注意:DEPC有致癌之嫌

二、  关于Trizol Reagent的使用过程:

1.  Homogenization(匀浆)

a.  Tissues:组织
每100mg组织匀浆加1mlTrizol试剂,样品体积不能超过Trizol试剂的10%。

b.  Cells Grown in monolayer(单层细胞接毒后出现病变的)

针对JEV细胞总RNA的抽提法:

BHK21细胞长成单层后,接毒0.5-1ml(采用大瓶),37℃吸附1h,倒掉,加维持液(含2%的血清和HEPE8的MEM)约5ml,维持天。出 现75%-100%的病变时,以PBS(预冷)冲洗细胞两次,直接在细胞瓶中加入Trizol试剂1ml/10cm2,吹吸几次,以裂解细胞(细胞瓶有两 种常用规格:大的约45cm2,小的约30cm2,故所用Trizol试剂分别约为4.5ml和3ml。Trizol试剂的加入是依细胞瓶而定,以盖满瓶 底为度,而不是依据细胞的数量,否则可导致DNA的污染)具体方法如下:(样品一定要新鲜)

(1)  组织接入预冷的EP管中,加入Trizol试剂1ml/10cm2(量一定要加足,否则易污染),混匀,吹吸几次,以破裂细胞,置室温5min,以使核蛋白复合物彻底分离。

(2)  加氯仿0.2ml(每1ml Trizol试剂加入氯仿0.2ml),盖好,剧烈震荡15s,置室温2-3分钟。

(3)  4℃离心,10000g×15min,离心后,混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、上层为无色的水相。RNA包含在水相中,水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%。

(4)  仔细吸取上层水相,移至另一EP管中。

(5)  加0.5ml异丙醇,以沉淀RNA(每1ml Trizol试剂加入0.5ml异丙醇),置室温10min。

(6)  4℃离心,10000g×10min。RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁。

(7)   弃上清液,加入预冷的75%乙醇1ml(每1ml Trizol试剂加入75%乙醇至少1ml),震荡,充分洗涤沉淀,4℃离心,5500g×5min。弃上清液,空气干燥(或真空干燥)后,沉淀重悬于无 Rnase dH2O中,吹吸几次,55℃-60℃作用10分钟以溶解RNA,-70℃保存备用。

(8)  抽提出的细胞总RNA干燥后加水50ul,取10ul加无Rnase水990ul,稀释100倍成1ml。于0.5cm厚的石英比色杯中,以无Rnase水为对照,在721型紫外分光光度计下检测,结果应为:A260/280 ratio<1.6。

(9)  分离组织10mg(纯组织)加800ul Trizol试剂。

(10)  扩增产物的鉴定。

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   作者: dehuixu


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