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操作步骤

（1）用包被Buffer稀释的重组人TFAR19（1mg/ml）包被ELISA板, 100ml/well, 37℃孵育2h或4℃过夜（一般24h以上）。

（2）洗涤Buffer洗板三次，加入封闭液，200 ml/well ， 37℃孵育2h或4℃过夜。

（3）洗涤Buffer洗板三次，加入不同稀释度的病人血清（3个重复孔）100ml/well ，37°C孵育1h。设包被Buffer、洗涤Buffer 、封闭液为阴性对照。

（4）洗涤Buffer洗板三次，加入1：2500稀释的HRP标记的抗人IgG, 100ml/well，37℃孵育1h。

（5）洗涤Buffer洗板三次，加入显色液，100 ml/well，避光反应10~15min。

（6）加入H2SO4终止反应，50 ml/well。

（7）ELISA Reader 读取OD490 光密度值，分析和比较病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗体的表达水平。

2、Western blot 分析原发性肿瘤细胞和正常细胞的TFAR19蛋白的表达水平。

请问hoechsts33258和hoechst33342有什么不同？是不是33342主要用于悬浮细胞，而hoechst33258主要用于贴壁细胞？如果我用hoechst33258和PI做双标，应该怎么办特别是 细胞怎么处理？谢谢

丁香网友midas认为：hoechsts33258，hoechst33342二者区别不大，但是hoechst33342对细胞的毒性作用更小一些，所以一般来说hoechsts33258用于细胞固定后再染色，而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色！这么说来，如果您用hoechst和PI做对活细胞进行双标，那么就最好选择hoechst33342，这是就可以直接将染料加入培养液中，之后固定观察；但是如果一定要用hoechsts33258，那么就最好是：固定－－>染色－－>观察。

我最近的实验很不顺，我将载玻片用左旋多聚赖氨酸包被后放与六孔板中，但是很容易污染，不知各位高手有何高招。

丁香网友midas认为：载玻片、PLL、六孔板、培养液及玻片确保无菌，最重要的无菌操作技术！

细胞凋亡的图片1

细胞凋亡的图片2

细胞凋亡的图片3：组织培养中内皮细胞的 apoptosis

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细胞凋亡的图片6