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小鼠ES-R1细胞系传代：

因为我们用饲养层细胞铺皿而不是明胶包被，所以传代之前必须处理饲养层细胞。

1.饲养层细胞STO处理：当STO铺满平皿后，向培养液中加入100ul 1mg/mlmitomycinC(toxic, 操作时不要接触，作用是抑制STO增殖)，轻轻摇晃平皿，保证丝裂霉素分布均匀，放置于培养箱中处理2h后，吸弃培养液，10mlPBS洗两遍（目的是把 mitomycinC洗净），0.25%胰酶消化，5ml(DMEM+10%FBS)终止，离心1000rpm*5min弃上清，加 DMEM+10%FBS后吹打均匀，种到新的100mm细胞培养皿，补齐培养液至10ml。置于培养箱中过夜。

2.第二天早上传干细胞：

（1）吸弃旧培养液，10mlPBS洗一遍，2ml 0.25%胰酶消化，边消化边轻轻晃动培养皿，4-5min后镜下观察发现发部分细胞脱落，成小的细胞团块，加8ml DMEM+10%FBS终止消化，轻柔吹打。

（2）然后将液体转移到15ml塑料离心管中，静置10-15min，吸弃上清，加2mlES培养液。

（3）将滴管在酒精灯下拉成非常细的玻璃管，吹打1－2次，尽量将ES吹散

（4）将前一天铺好的STO的培养液吸弃，换成10ml的ES培养液（操作要小心，不然STO很容易脱落），再把塑料离心管中的ES1:3或1:4(视情况而定)传到铺好的STO皿中，前后左右垂直晃动几下，使干细胞分布均匀，置于培养箱中，每天换液，两到三天传代。

应该注意的问题：

1.STO不管是在ES传代还是换液过程中都可能因为加液体速度过快而脱落，所以最好靠近培养皿壁先一滴一滴加，避免液体直接打在STO上。

2.玻璃管拉得尽量细一些。

3.一定要把mitomycin洗干净

HepG2细胞株的传代经验：

首先在倒置显微镜下观察生长融合达80%，不需要长满，就准备传代。倒掉旧的培养基，再用已经高压灭菌过的PBS洗1－2次，我用的是25平方厘米的培养 瓶，加入1毫升已经配制好的0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA(0.25%胰蛋白酶是用D-Hanks配制后先用滤纸过滤，再用一次性过滤器过滤除 菌，再分装成1ml的小包装，刚好每次用完一个，避免每次反复冻存，会使胰酶的活性下降），加入的量以刚好盖满瓶底为宜。放到倒置显微镜下观察变化，一旦 发现细胞开始变园收缩，大约1－3分钟时间，必要时可以吹打帮助细胞分散，就立即加入培养基中和胰酶，如有EDTA最好要离心 （800rpm,5min)，弃上清夜，再加入完全培养基吹匀，再分瓶，一般一瓶可以分2－3瓶。放入5%的CO2培养箱，37度培养24小时后观察。

hela细胞的培养条件为：

高糖DMEM培养基,100ml/l胎牛血清;培养液中一般血清含量为10%

传代步骤: 1． 倒去细胞培养液(对于小口的培养瓶可采用顷倒方法,对于培养皿,必须用吸管吸出)

2． 吸取适量的PBS加入培养瓶中,轻轻振荡后弃去重复一次,以清于血清成分,

利于胰酶消化

3． 加入适量0.25%胰蛋白酶（一般100mm培养皿可加入1ml，15cm 培养瓶加入5-8滴）转动培养瓶，使其湿润整个细胞房，高温下消化2-3分钟。

翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层，见细胞单层薄膜出现针孔大小空隙时即可顷去消化液，如消化程度不够可延长消化时间，或置于37°C孵箱中加速胰酶作用如见大量细胞片装脱落，已消化过头，则不能顷倒消化液而直接进行下一步操作

4． 加入适量培养液终止消化

吸取瓶中培养液反复冲瓶壁上的细胞层，至全部冲下轻轻吹打，混匀，成细胞悬液取样计数，调整细胞浓度为5′10 /ml

15cm 培养瓶培养时，吸取1ml细胞悬液加到新培养瓶中，加入4ml培养液，盖好,置37°C孵箱中培养。

传代的天数要以HELA细胞的生长密度为基础,细胞密度大了就要传,应该每天观察HELA细胞,注意其生长状态.HELA细胞的生长分5期:

游离期

细胞经消化分散后，由于愿生质收缩及细胞弹性，细胞成圆形，折光性强，呈悬浮状态。

吸附期

接种24小时后，由于细胞的附壁特性，开始贴壁，圆形细胞变成延展状态。

繁殖期

细胞快速生长、分裂，形成细胞岛直至细胞单层。

维持期

细胞形成单层后生长与分裂减缓、折光性减弱，细胞内颗粒增多，由于代谢物的积累，CO2增多，培养液变黄。

衰退期

如不及时换液和传代，由于营养缺乏、代谢物积累，细胞内颗粒进一步增多,立体感差，细胞皱缩、脱落、逐渐衰老死亡。

应该在其维持期和衰退期及时换液.一般而言是4天换一次液.

祝你实验顺利!

S180肿瘤细胞的,S180腹水型肿瘤细胞平时可以在小鼠腹腔中转种传代.我们科室保种时就这样的.

在有的试验时需在培养瓶中培养一段时间,由于其增殖较快,培养时密度不宜大,一般10*5/ml就够了;通常2天就需换一次液,由于其是悬浮细胞，无须消 化,直接离心去上清,PBS洗涤,用含10%小牛血清的RPMI1640培养液就可以了.其要求条件相对较底,一般培养室都能达到.

我平时还养小鼠的淋巴细胞,我们养的是混合淋巴细胞,不是单一的细胞株(或系),主要特点是如果需要传代培养要加IL-2(出于经费考虑,我们就用人源 IL-2,因为IL-2具有沿种系普向上约束性,而乡下无约束性)50~100u/ ml,换液时可以离心去上清,可以用PBS洗涤两一 次,加入含10%小牛血清就可以了,其他注意事项同一般的培养.

小鼠成肌细胞C2C12和人横纹肌肉瘤A204细胞的消化传代方法供大家参考:

1)细胞消化液的配制及存储:我采用的是0.25%Trypsin+0.05%EDTA的消化液,BUFFER采用的是D-Hank's液.配完后分装成4-5ml/tube,于-20度冰箱中储存.

2)消化前的处理:当细胞生长至亚融和状态需要传代时,提前半小时将配好的消化液放在细胞培养孵箱中预热,同时将配好的高压无菌的D-Hank's液也进行预热.

3)消化细胞:将预热的D-Hank's液洗细胞2次,2ml/25cm2,然后再加入预热的消化液,作用3-5min,并反复振荡,镜下观察.当细胞被 消化成单个圆球状时,加入等体积的培养基中止消化,然后反复吹打,将消化后的细胞悬液,全部吸出后置于离心管中离心,1000rpm,10min.

4)传代接种细胞:离心完毕后,弃去上面的上清,加入新鲜预热的培养基,并计数,按要求接种的密度接种到新的培养瓶中即可.

这种方法的优点是:细胞消化彻底,损伤小,接种均匀,易于控制密度等.

hepa1-6和p19细胞：

hepa1-6是小鼠肝癌细胞，p19细胞是小鼠畸形胎瘤细胞，前者须用10%胎牛血清的DMEN养，后者须用10%胎牛血清的FD养，且经常在传代初期出现生长状态不好，要反复洗涤后换液，多观察。

Ecv304细胞的培养：

Ecv304细胞也很好培养．用含有10%小牛血清的DMEM培养，一般２－３天长到８０％即可传代，传代是吸去培基，，用ＰＢＳ冲洗，加入0.０5%的 胰酶＋0.02%的EDTA，３７度消化１分钟，加含有10%小牛血清的DMEM终止消化，吸管轻轻打散细胞，然后加培基放入37度二氧化碳培养箱中培养 即可．

小鼠肝癌H22体内传代的详细步骤：

1.腹腔种植小鼠肝癌H22细胞后第5-7天时，将小鼠颈椎脱臼处死，于75%酒精浸泡1-2分钟或腹部消毒。

2.于无菌条件下用5 号针头注射器抽取腹水，并置于10～50 ml离心管内，用生理盐水(NS) 10倍稀释，吸管充分吹打均匀，1 000 r/min-1离心5#ml 7 min，倾出上清，按一定比例加入生理盐水，配制成瘤细胞悬液5-10*10^7/ml，0.2 ml/只，接种到小鼠腹腔。

3.为简单起见，也可将抽取的腹水用生理盐水做简单稀释（1：2～1：4），0.2 ml/只，腹腔传代。

4.下次传代时，重复以上步骤即可。小鼠肉瘤S180腹腔体内传代同上。

H22小鼠肝癌细胞株是腹水型细胞株，悬浮生长。液氮冷冻保存。使用时取出复苏，用1640加10%新生牛血清培养，三天后取液计数成1＊108浓度，取 0.08ml注入小鼠腹腔，7天左右腹水可用，一般要低速离心去掉巨噬细胞等混杂细胞，腹水得到的细胞比培养瓶中生长的细胞活力高，皮下接种成瘤率为 100％。本法传代可靠性高，细胞活力强，致瘤率高。

神经胶质细胞传代经验：

1、倒掉培养液,用D-HANKS洗两次

2、加入0.125％胰酶/0.02％EDTA（1：1），盖满瓶底为宜。

3、将培养瓶放置显微镜下进行观察，发现细胞间隙增大，突起回缩后竖起培养瓶，倒掉消化液。

4、用D-HANKS洗一次，此时动作要轻

5、加入完全培养液，轻轻吹打混匀，接种至培养瓶中。

注意：

1、0.125％胰酶/0.02％EDTA的PH值和温度重要，即PH值（7.5），温度

（37℃）

2、如果消化速度过快，细胞掉下来，也不要紧，加D-HANKS或完全培养液终止消化，离心1000r/min，10分钟即可

3、轻轻吹打

大鼠肝癌细胞系CBRH7919是我国自己培养的细胞系，最初是用二乙基亚硝胺诱发的Wistar大鼠肝癌组织传代而成。此细胞系增殖力很强。

传代方法：细胞长到90%以上，弃培养液->0.25%胰酶消化->消化时间1.5-2min->吸弃胰酶->加入1640培养液，10%胎（小）牛血清->传代（一般一传三）

如胰酶消化时间增加，可通过离心沉淀细胞后加入培养液传代，但这样增加传代时间，而且该细胞系粘附性较强，离心后易形成细胞团，且不易分散。

293细胞：

293贴壁很不牢，可以不加消化液直接吹打下来，但这样下来的细胞容易聚成团，传代后形态不大好看。可以先倒掉培养液，以D-HANK'S液轻轻冲洗，再 加0.6ml 0.25%胰酶/0.01%EDTA，轻轻润湿细胞后即可弃去，置于镜下观察，很快即可见细胞变圆，加入适量完全培养基终止，轻轻吹打即可。这样细胞既不 会消化过头，又极尽吹散。

膀胱癌 T24细胞（贴壁的）：

心得如下：

1、 T24长的非常快，传代一般1：5传，每4天需要再传。

2、虽然是永生化细胞，也一定不要等细胞100%汇合再传代，多次这样细胞状态不好，球形增加，还不容易洗掉。

3、要用胰酶（0.25%）--EDTA（0.01%）混合消化液消化好些，一般1分钟内呈球形，即可混悬细胞了。

4、培养液用10%小牛血清的DMEM或1640都可以。

步骤：吸净培养液， PBS洗2次，加消化液室温一分钟左右，要在显微镜下注意观察，不要过头，球形后，吸掉消化液，加1毫升培养液，吹打混匀，1：5传代。

SMMC－7721，肝癌细胞株：

1、 SMMC－7721开始长的比较慢，呈花瓣状，成片后迅速增殖，细胞由于过密开始变小，如果不及时传代，会清楚的看到细胞张成两层，下层细胞大一些，上次呈圆形，小。

2、3-4天可以传代，传代时稀释度视情况而定，一般1：3 - 5

3、用胰酶（0.25%）--EDTA（0.01%）混合消化液消化，消化时间较长，大约5分钟，当细胞过多时时间更长，建议分两次消化，既先消化下来的一部分倒出加培养液（培养液用10%小牛血清的1640)终止，剩下的细胞继续加消化液消化。

步骤：倒净培养液，胰酶洗1次，倒尽，加胰酶消化液置于37度，在显微镜下注意观察，细胞变圆后，倒掉消化液，培养液，吹打混匀，1：3-5传代。

293T,贴壁细胞：在消化传代过程中，步骤如下：

用滴管吸尽旧的培养液－＞用培养基洗一次－＞加入一定量的胰酶（已预热）-＞显微镜下观察，待细胞大部分变圆时，回到超静台－＞用滴管吸尽酶液－＞加入一 定量的含血清的新培养液－＞反复吹打细胞－＞再置显微镜下观察，直到细胞全部悬浮起来－＞吸出一部分加入新的培养瓶中－＞最后再补充加入一定量新的培养 液，放入培养箱。

可用含有血清的DMEM，也可以用含有血清的1640。

HELF(人胚肺成纤维细胞),这也是一种贴壁生长的细胞,所以传代培养时的大概方法没有什么不同.但这种细胞贴壁贴得不是很紧,所以消化过程中有几点注意事项(本人总结):

1.当倒出原有培养液时,最好将培养瓶反过来,即有细胞的面朝上.

2.如用EDTA消化,最好先让其消化3分钟,后每一两分钟看一次.

3.每次看时不要太过晃动瓶子,以防细胞成片脱落.如果细胞成片脱落了就比较麻烦了,因为细胞已经脱落,就不得不终止消化,但实际上细胞与细胞间的连接并没有完全断开,吹打也分不开,那样分出来的细胞也就成团,则不利于细胞贴壁及生长.

4.如果在终止消化前有细胞脱落,不要浪费,先加Hank's液终止消化,然后离心,收集细胞,再让其生长.

5.细胞生长状态好时,一般5-7天可以长满,其间换一次液就可以了.

6.但我也遇到过生长不太好的情况,细胞长了12天才长满,且其中有几天几乎没长或出现大量黑色死细胞团,这时不要放弃,只要活细胞不是太少,没有关系. 之所以长的慢或有死细胞,大概是消化时EDTA的损伤造成的,细胞恢复活性需要一定时间,且一旦活性恢复,细胞将长得很快.

人肝癌BEL-7402细胞传代步骤：

1. 弃去旧培养液（可用巴氏吸管吸去，也可直接翻转培养瓶，使培养面朝上，直接倒掉培养液）。

2.PBS冲轻缓漂洗细胞两遍，尽量洗去残余血清，弃PBS液。

3 加0.25%胰酶（以盖满瓶底为标准）于37度条件下消化，倒置相差显微镜下观察，细胞解离程度以细胞突起回缩，细胞间隙增大，细胞近乎缩成圆形为准。

4.直接加含血清的1640培养基（或血清)终止消化。

5.用弯头吸管均匀有序的吹打细胞，动作不宜过猛，防止起泡产生。

5. 离心5分钟（1000转/分钟），去上清。加入PBS液吹打混匀，再离心一遍。

6. 用含10％小牛血清的1640培养液重悬细胞，按1：3传代！

7.补加培养液至所用培养瓶容积的1/10为准。

8.送孵箱培养。

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的消化及传代，RAW264.7因是单核巨噬细胞其生物学特性就是贴壁特别牢。

我的操作如下：

实验前将DPBS及DMEM加温到37度

使用Flask75培养瓶：

1、细胞贴壁生长，长满瓶底70％时，弃去培养液，加DPBS10ml漂洗 一至两次；弃去

2. 加入10mlDPBS,然后用scratcher轻轻刮即可，离心后去除DPBS.用DMEM培养液10ml复吹打混悬细胞

3.分入新的培养瓶；

4. 入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁 。

卵巢癌细胞SKOV3,贴壁生长，传代步骤：

1.倒掉旧培养液，尽量倒净。

2.如果是50ml的培养瓶，加入约1ml0.25％胰酶中和残留培养液，倒出。也可用D-HANKS液洗一次，可以节约胰酶。

3.再加1ml0.25％胰酶消化，本人体会，新开瓶（指分装的小瓶）使用的胰酶消化能力强，可以减少用量至0.5－0.8ml,已用较久的胰酶如用少了就不管用。

4.镜下观察，如果80％以上细胞都回缩变圆，立刻将培养瓶竖起，防止过度消化。

5.倒掉胰酶，用含10％小牛血清1640培养液5ml加入瓶内，按顺序轻吹打，如瓶底由模糊变透亮，说明细胞已从瓶壁吹离。

6.此种细胞生长较快，所以一般按1传5－6传代，按瓶数补足培养液，吹匀后分别接种到新瓶中。

7.根据培养液颜色变化所提示的酸碱度变化，一般2天左右换液一次。

人脐静脉内皮细胞株ECV304：在含体积分数为10%胎牛血清（FPS）的RPMI1640培养液，37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度条件下培 养，3-4d换液传代一次。实验时采用对数生长期细胞。传代时先倒掉旧培养液，用pbs５ml洗两遍，再加入0.25%的胰酶+0.01%edta，加入 的量以能覆盖瓶底为准。加入后轻轻摇晃培养瓶使液体覆盖瓶底，然后大约半分钟左右看一次，对着光源观察瓶底细胞黏附面是否有裂缝（如有则在显微镜下可见细 胞之间出现间隙且有大部分细胞呈现圆形），倒掉，加入含低浓度血清培养液，然后吹打瓶底各处使细胞脱落。离心后去除上清液，加全培，再分４瓶，补加培养 液。这样操作步骤可大大简化，不需要将培养瓶拿出拿进操作台了．

附:消化缓冲液(0.25%)胰蛋白酶： 胰蛋白酶干粉1.25g，0.1gEDTA，溶于50ml 10×D-Hanks溶液中，调节至PH 7.6，定容至500ml，22um滤膜过滤除菌，分装后-20℃保存备用。