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7、PC 抽提

PC 抽提是去除蛋白质的一个非常有效的手段。苯酚能使蛋白质变性，变性后的蛋白质从水相中被析出，处于苯酚中或者苯酚/水相之间。PC 抽提的关键是，一要混匀彻底，二要用量足够。彻底混匀，才能确保苯酚与蛋白质的充分接触，使蛋白质完全变性。许多人总是担心混匀的剧烈程度是否会对核酸，尤其是基因组DNA 造成破坏，实际上大可不必如此小心。剧烈的混匀操作，是会对部分打断大分子的基因组DNA，但该破坏作用不会强烈到DNA 变成10kb 以内的小片段。手剧烈晃动混匀后，基因组DNA 的片段，大部分会大于20kb，这个大小，除了一些特别的要求外，对PCR 和酶切，都是完全适用的。如果要求的片段非常大，如构建文库用，则不能使用剧烈的混匀方法，而只能来回温和颠倒混匀—此时的关键是：裂解液的比例要足够大，使体系不要太粘稠。用量要足够，是因为苯酚去除蛋白质是有一定的饱和度的。超过了该饱和度，裂解体系中的蛋白质不会被一次去除，必须靠多次抽提，方可彻底去除。另外，体系太粘稠的坏处是，蛋白质难以彻底去除，以及基因组DNA 会断裂得更厉害，所以要注意裂解液与样品的比例。

8、样品与裂解液的比例

起始样品用多大，并没有具体的说法。如果不是样品量有限，则以能抽提出满足数次成功实验所需的核酸量，作为决定样品起始量的基础，会比较合理的。不要因为1ml 裂解液可以抽提100mg 样品，就一定使用100mg 样品。裂解液的用量，表面上与抽提的结果（纯度及得率） 没有关系，然而，在实际操作中，对结果是有比较大的影响的。裂解液的用量原则是：确保能彻底裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中。浓度过低，将导致沉淀效率低，影响得率；浓度过高，去除杂质的过程复杂且不彻底，导致纯度下降。另外，裂解液的用量是以样品中蛋白质的含量为基准的，而不是以核酸含量为基准，这一点务必牢记。

9、蛋白质是如何残留的

PC 纯化：a-取上清时取到中间层及下层；b- PC 用量不足；c-混匀不彻底；d-溶解于上清中的少量PC 中含有的蛋白质。

高盐沉淀：a-取上清时取到了蛋白沉淀；b-裂解不彻底；c-裂解液用量不足，使裂解体系太粘稠；d-溶解度问题 (可以使用低温沉淀加以改善)。

介质：a-裂解不彻底；b-裂解体系太粘稠。

10、小分子物质 (苯酚、盐) 是如何残留的

醇沉淀：洗涤不彻底。其原因与管子、操作手法等有关。

介质：颗粒状介质的原因与醇沉淀相同。柱式的几乎都是柱子设计上的缺陷所致，极少数由操作者未严格按要求操作所致。

11、标准化的概念

所谓的标准化，指的是一套程序，确保不同的人能获得质量接近的产物的程序。标准化并不是以获得最高质量为目标，而是以稳定为目标。标准化的核心是质控。

事实上，核酸抽提的每一步操作，都有一个核心；重要的是找到可观察的指标或者现象作为参考，从而确保实验的成功。如悬浮的核心是没有块状物的存在，彻底消化的核心是没有块状物的存在，PC 抽提的核心是混匀-两相成为乳状，取上清的核心是用小一点的移液器移取液体，吸取时Tip 的尖头尽可能接近液面，吸取速度要慢，并且要留下1mm 以上的液体不要再吸。去上清的核心是先倒空，再短暂离心将残留液体离到管低，用移液器彻底移出。洗涤的核心是彻底悬浮沉淀，并且要放置一段时间（时间长短与沉淀大小有关）使沉淀内部也能被洗涤到。按这样的方法抽提的核酸，其质量是非常稳定的。

柱离心式实际上就是非常标准化的核酸沉淀与洗涤的操作。一般而言，柱式操作出问题，系统性的与试剂盒有关，偶然性的与操作有关。这一点，应该是可以理解的。

一个方法，其标准化程度越高，其稳定性就越好。步骤越少，标准化就越容易。产品的开发也要以高标准化程度为目标。

12、QC 的概念

QC 概念远没有QT 概念深入人心。最高境界的产品追求的是免检，或者是Trouble-free。另外，现在的许多产品也是不允许QT 的 （因为是一次性的），因此就只能靠QC 来保证质量了。QC 是将精力集中在过程中：原料、操作等。只要严格按照标准去做，最终的结果就有保证。事实上，很多实验人员是不做检测而直接将抽提好的核酸用于后续实验的；他们之所以可以这么做，是因为他们有意无意之中非常的注意QC。也有不少人，尤其是新手，Pay no attention to QC，只知道最后的QT。一旦发现问题，就去逆推原因；但因为过程中所出现的现象根本就没有注意，几乎不可能准确找出真正的原因的。如果QC 做得好，最后的QT 是否全部做/部分做/完全不做，取决于时间、经验、后续实验的成本等因素。

13、EP 管的问题

几乎没有人会认为EP 管的质量会与核酸抽提的操作有关，与某些现象（如核酸在-20℃ 保存一天后发生了降解）有关系，但事实是，EP 管的质量的确与核酸抽提的质量以及核酸保存时的稳定性有关。

硅化可以提供最高质量的EP 管，使某些奇怪的现象消失或者大大减轻。最糟糕的EP 管对液体有较强的吸附力，在倾倒液体时残留多，核酸在管中保存的过程中会发生变性。这样的管子是很有市场的，因为便宜；而正因为便宜，其材料总是不令人放心的。

我个人认为，只有硅化过的EP 管，才可能按照标准操作获得满意的结果。否则，某些操作步骤必须调整，才可以获得稳定的质量。

14、核酸抽提中的温度问题

核酸抽提中的温度问题，也是一个值得关注的问题。首先要明确的一点是，任何一个温度条件，对某些方面有利，同时也一定会有不利的一面。如沉淀，低温操作会提高得率，但也会增加杂质的残留。任何一步操作该用什么温度为好，应该是利弊权衡的结果。基本上，除了一些特殊的步骤，如消化等外，用室温是最好的选择。那些认为“低温操作可以防止降解”之类的理由，并没有多少可信度的。

15、如何阅读操作手册

拿到操作手册后，要倒着阅读：先阅读问题解答，再看操作步骤下面的说明，再看操作步骤。问题解答是别人在使用过程中曾经碰到过的问题集锦，操作步骤下面的说明是商家的警告。没有一个商家会将他的操作步骤写得非常复杂，因为这是满足使用人员习惯的结果。一句话，PS 和By the Way 之类的话中含有真正的有用素材。

16、其它

核酸抽提的每一步操作，都是利弊权衡的结果。消化要彻底，时间就会长；PC 抽提时多取上清，得率会提高，但增加了蛋白质污染的风险；沉淀使用低温且时间长，得率会提高，但增加了杂质污染的风险 … 不足详列。总之，核酸抽提是艺术，可以根据自己的样品及当时的情况，对操作步骤进行适当的优化。

17、实验的思维

核酸抽提的成功，就是每一步都没有失败。这不是玩文字游戏，而是告诉你做实验的良好思维。就如同小学基础没有打好，早晚会发现大问题一样，做实验决不要以成功为喜悦，以失败为痛苦。要保证实验成功，绝对不能有“这个操作应该没有问题”，“用这个可能不会有问题”之类的侥幸心理。去掉任何一个可能使实验失败的因素，这才是实验该有的出发点。用这样的出发点，实验几乎没有不成功的，所以说，实验成功没有什么快乐；实验的快乐来自于：发现自认为不会导致失败的某因素实际会导致实验的失败。学到了这样的知识，才有快乐的理由。

18、EB 在NA 抽提中的运用

EB 在NA 抽提中的应用，用于电泳，人皆尽知；用于gDNA 抽提时提高蛋白质与gDNA 的分离效率，却似乎没有人再考虑了，因为大家都怕使用EB。在 NA 抽提中涉及到EB 的另外一大类，就是胶回收操作了；EB 在胶回收中扮演的角色，就不完全是正面的。

如果NA 与EB 充分接触，EB 就会以每隔数个碱基的频率均匀地插入NA 之中。EB 的这种插入，无疑更可能破坏核酸双链的稳定性，使核酸由双链变成单链的压力增加。如果核酸比较短，而错配又多（错配的后果之一也是核酸容易由双链变成单链），EB 的插入将更容易导致的出现。这个观点有如下的实验报告佐证：有相当部分的PCR 产物胶回收实验，都报告说回收后的电泳结果是：目的条带变淡或者消失，同时出现了一条小的原来不存在的条带。

坛中曾有文描述他做胶回收的程序：两边加Marker，中间加产物；电泳过程不含EB。电泳结束后，纵向割下Marker 条带用EB 染色后，放回胶原来的位置。开紫外，根据Marker 的位置割下目的条带，再回收。这是个笨办法，但这样使用的人一定是聪明人。

19、核酸的保存

基本上，核酸在保存中的稳定性，与温度成反比，与浓度成正比。虽然也有部分实验人员发现，-20℃保存的DNA 比-70℃保存的稳定，我却宁可认为这是个例。

如果温度合适，保存中核酸发生降解或者消失，首要原因是酶残留导致的酶解，第二个原因则是保存核酸溶液的 pH 值不合适导致的水解。还有一个不为人重视的，就是EP 管对核酸的影响。首先一定要坚信一点，那就是核酸一定会与装它的容器的接触面发生反应，达到某种均衡。EP 管的材质，首先可能媳妇核酸，其次还可以诱导核酸的结构发生某些变化，如变性。在核酸的浓度比较高时，这个现象可能观察不到；当核酸浓度很低时，则比较明显了。在低浓度的核酸中加入Geletin、Glycogen、BSA 可以稳定核酸，虽然已经为实验所证明，但许多实验人员并没有将该建议当回事。

现在制造EP 管的材料远多于过去。这些新出现的材料，在强度、透明度等物理特征方面可能比原来的纯PP 材质要好许多，但其化学特征，尤其是对核酸稳定性的可能影响，远没有研究透彻。正如现在的质粒可以改造得越来越适用某些要求一样，其负面产物可能是，抽提的质粒电泳的构型越来越多：除了原来的三种带型外，还可能出现denatured cc 、multimeric forms of cc 等等带型。


编辑：西门吹血