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六、融合与筛选

最重要的一步是融合，我想这也是单抗制备过程中最难的一步了。

（一）细胞融合流程

1.　取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。
2.　同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。
3.　将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm，8分钟。
4.　弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。
5.　轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。
6.　在室温下融合：
①30秒内加入预热的1ml45％PEG（Merek，分子量4000）含5％DMSO，边加边搅拌。
②作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。
③加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔２分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。
7.　离心，800rpm，6分钟。
8.　弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。
9.　根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。
10. 将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl/孔，37℃、5％CO₂孵箱培养。
一般一块96孔板含有1×10⁷脾细胞。
　
（二）HAT选择杂交瘤

应用HAT 选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。

一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50×贮存，用时1ml加入50ml20％小牛血清完全培养液中。

因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200μl/孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2/3进行选择，可得到满意的筛选结果。
　　50×HAT
　　H：5×10-3M
　　A：2×10-5M
　　T：8×10-4M

一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。

融合的关键除了无菌操作之外就是动作一定要轻柔，就像制备感受态细胞一样，而且一定要混匀，不然在镜下会出现成团的细胞，这是很影响本就不高的融合率的。

论坛资源：

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单抗细胞融合为何不成功

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（请教）作单抗细胞融合时间的选择

求助单抗融合后细胞不分裂

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（求助）请问做单抗融合前的血清效价需要多少?

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请教单抗！

（专题讨论）杂交瘤细胞

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（求助）融合的杂交瘤细胞一般要经过几次筛选

（求助）关于杂交瘤的筛选

（请教）杂交瘤问题

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（请教）有关ELISA筛选单抗的筛选标准问题

七、抗体的鉴定
　
筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。
　
检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。

常用的方法有：
1.　ELISA用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等McAb的检测。
2.　RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。
3.　FACS（荧光激活细胞分类仪）用于检查细胞表面抗原的McAb检测。
4.　IFA用于细胞和病毒McAb的检测。

可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。

论坛资源：

（请教）间接ELISA检测单抗时，阴性对照最好用什么？

（求助）关于单抗ELISA检测值的不稳定