免疫细胞化学在神经科学中的应用

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发布日期：2012-07-23 18:04 文章来源：丁香园
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免疫细胞化学的发展对许多领域的研究起到很大的推动作用，在神经科学的研究中尤为突出。本章仅就免疫细胞化学在神经科学的基础研究方面的应用做一简要介绍。

一、确定神经递质的性质、定性和分布

早期的神经科学工作者应用传统的神经解剖学研究方法如甲基蓝染色法、镀银染色法等对中枢及外周神经系统的结构做了大量的研究工作，但由于技术方法的限制，对神经递质的性质无法确定。1949年Koelle建立了胆碱酯酶染色法（cholinesterase staining method, ChE）1964Rh ，Karnovsky 和Roots在此基础上改良并建立了一步完成的乙酰胆碱酯酶（Acetycholinesterase,AChE）直接染色法，使显示胆碱能神经成为可能。从生物测定来看，AchE和胆碱能神经的标志酶存在平行关系。因此，一般认为，在加用乙酰胆碱酯酶抑制剂的情况下，用Ache 显示胆碱能神经，仍不失为一种简便易行、可信的技术方法。但必须指出的是，一些接受胆碱能神经支配的细胞（称为胆碱能敏感细胞）和一些非神经细胞（如红细胞和骨骼肌）也可呈AchE阳性反应，甚至中枢神经系统内去甲肾上腺素（NA）能神经元集中的部位—蓝斑也呈现AchE阳性反应。因此，AchE阳性反应的不能就简单地确定为胆碱能神经元或神经。

50年代，Eranko就已发现用甲醛水溶液可使肾上腺髓质内含NA的神经细胞发生荧光。瑞典的Falck和Hillarp（1962）在此基础上改良并建立了用冷冻干燥和甲醛蒸汽诱发荧光，1974年Lindvall 和Bjorklund（1974）和de la Torre等（1976）相继建立和改良了乙醛酸诱发荧光法，开展了荧光组织化学的新篇章　；为研究单胺类神经递质的定位和分布提供了手段。

70年代以来，免疫细胞化学技术的应用，使我们在对上述经典神经递质研究的基础上又迈进了一大步。与上述方法相比，免疫细胞化学技术具有较高的敏感性和特异性，例如应用胆碱能神经元的标志酶—胆碱乙酰移换酶（Choline acetylase, ChAc）的单克隆抗体就能较AChE法更准确地确定胆大能神经元，同样，应用多巴胺羟化酶（DβH）抗血清能较甲醛或乙醛酸诱发荧光法更为准确地研究NA神经元及其通路，而且不需借助显微分光光度计测定各种单胺递质呈现荧光的不同波长加以区别，免疫细胞化学应用不同的标志酶免疫染色就可区别各种神经元和/或确定神经元内所含的不同的神经递质。如DβH免疫反应阳性在哺乳动物即可做为NA能神经元的标志，因为哺乳动物不存在其它合成NA的酶，所有合成NA的部位均有DβH。酪氨酸羟化酶（TH）和多巴脱羧酶（DDC）阳性表示多巴胺（DA）能神经元系统，而TH，DDC，DβH和苯乙醇胺位甲基移酶（PNMT）免疫反应阳性即为肾上腺素（E）能神经元系统。

借助免疫细胞化学技术，至目前为止，还发现了有40种以上的神经肽分布于中枢神经、下丘脑、垂体、松果体、脊髓、神经节　及外周神经系统特定的神经元中。在脊椎动物，这些肽类物质在体内的分布呈多位性，不局限于神经组织或神经内分泌系统，如原先在脑或下丘脑、垂体中提取的神经肽如脑啡肽（ENK）、生长抑素（SOM）和血管活性肠肽（VIP）等也存在于消化道的内分泌细胞和壁内神经丛中，反之，一系列先从胃肠道分离的肽类激素如胆囊收缩素（CCK）、P物质（SP）等也在神经组织中发现，如CCK在人和猪大脑皮质含量非常丰富，达11nmol/每克脑组织，P物质在脑中30处以上的地方存在，这些多肽被称之为脑肠肽（brain gut peptides）。在外周器官如消化道、呼吸道中的肽类物质统称为调节　肽（regulatory peptide），包括存在于消化道与呼吸道等器官内分泌细胞内的多肽（在消化道又称胃肠激素）和存在于器官壁内神经丛中的神经肽。虽然神经肽，包括脑肠肽在机体中的确切生理作用还有待研究，是作为神经递质、神经调制物（neuromodulator ）或神经激素（neurohormone）或二者兼而有之，还存在争论。但免疫细胞化学在神经科学中的应用已为我们开辟了一个新的研究领域，它确定在机体中除传统的胆碱能神经和肾上腺素能神经以外还存在第三上分枝—非肾上腺素能非胆碱能神经（non—adrener－gic non –cholinergic nerves, NANC）。Bloom等认为这第三种神经成分其末梢释放的递质是多肽类物质，又称肽能神经（Peptidergic nerves）。研究结果表明，机体全身的各个器官内都有不同种类和不同数量的肽能神经分布。在大鼠和丘脑下部、杏仁复合体，延脑内一些神经核和脊髓后角内均有较多的肽能神经元和纤维，小脑内仅有散在的肽能神经纤维，而大脑皮质内多数神经肽缺如，仅发现有CCK、SOM和VIP等数种。在消化道，存在一个壁内神经系统，Langley 称为胃肠神经系统（Enteric Nenvous System），现已发现其中含有VIP、SP、ENK、SOM等20余种神经肽，其它各脏器中也都有肽能神经分布。

二、探查和发现新的神经递质

免疫细胞化学可作为组织探针（Histological probe ），不断探查和发现新的神经递质。除上述的乙酰胆碱及其合成酶、肾上腺素及其合成酶、活性多肽以外，还可用以确定其它的疑义神经递质（Neurotransmitter chemical suspect）的性质和分布，包括5—HT及其有关酶类、γ—氨基丁酸（GABA）、甘氨酸、天门冬氨酸和牛磺酸等。

近年来，重组DNA工程与免疫细胞相结合而发展起来的原位杂交免疫细胞化学（In situhybridization Immunocytochemistry）作为组织探针，在发现神经系统特有的蛋白质和肽类方面。具有更高的特异性和灵敏性。重组DNA工程系列用制备的脑的多聚腺苷酸的mRNA，反转录为互补DNa （cDNA），克隆后与组织切片中的mRNA杂交，再按其cDNA核苷酸顺序推断出氨基酸顺序合成新的多肽，以此作为抗原，制备抗血清进行免疫细胞化学的研究，以发现新的神经肽。原位杂交免疫细胞化学技术，简言之，就是利用放射性同位素（或生物素）标记的cDNA片段与组织或细胞中特异的mRNA进行杂交来观察mRNA在体内的分布（详第二十章　）。发展这项技术，对发现神经系统特有的蛋白质或肽类，具有极大的潜力，如脑内特有的mRNA有30000种，目前已知的数10种神经肽仅占其中的一小部分。

编辑: gaowei2010

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