多能干细胞（pluripotent stem cells）
人多能干细胞（pluripotent stem cells, hPSCs）是目前生物学领域最引人注目的话题之一。之所以如此，是因为hPSC可通过改善机体再生能力，为治疗许多疾病提供了一个潜在的途径。此外，hPSC系统也适用于药物筛选和毒性测试。目前，有两种主要的途径制备多能干细胞：（1）分离人早期囊胚内细胞层，合适条件下培养，构建人胚胎干细胞（hESC）1；（2）使体细胞表达特定的转录因子，经过特殊条件培养，体细胞反分化为诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）2-4。
iPSC的制备
为阐明未分化多能干细胞的转录状态，人们利用各种技术进行了广泛的研究。对hESC的许多认识，为研制 hiPSC 提供了必要的基础。例如，在胚胎早期发育过程中，Oct-3/4 5、Sox2 6 和Nanog 7，8 具有独特的表达方式，对胚胎发育起着至关重要的作用，是维系多能干细胞特性的关键因子。通过以上研究，人们找到了使体细胞反分化的转录因子。体细胞重编程为iPSC的分子机制尚不清楚，为此，人们正在开展深入的研究，以阐明相关机制。此外，重编程的效率极低，制备过程长。因此，研究者正在对影响分化的因素，进行新的探索。这些因素包括：（1）重编程所需转录因子的选择；（2）转录因子导入细胞的方式；（3）靶细胞的选择；（4）转录因子在细胞中的表达参数，包括表达时间和水平；以及（5）制备iPSC的培养条件等。此外，鉴定iPSC的方法也十分重要9。
最早发现的转录因子组合，包括Oct4、Sox2、c-myc和Klf4，仍是目前重编程体细胞的主要因子。人们最初用病毒载体将因子导入细胞，使外源基因整合到细胞基因组中。基于临床应用安全性的顾虑，以及细胞插入畸变的可能性，人们对非整合的方式导入转录因子进行了有益的探索，如采用瞬时转染10、非整合病毒载体11及导入蛋白分子12等。尤其令人兴奋的是，某些小分子物质通过修饰基因组甲基化状态，或抑制某些关键信号通路，可以替代某些转录因子（见表1）。通过以上研究，人们将建立完全使用化学物质，使体细胞向iPSC分化的详尽程序。
表1 用于细胞重编程的小分子
使细胞重编程所需转录因子的数量，与采用的细胞类型有关。比如，神经干细胞本身就表达某些转录因子，因此使用一个转录因子即可使之重编程为iPSC 13。不同的细胞类型重编程效率也不同。小鼠胃和肝脏细胞比成纤维细胞重编程的效率更高，且更完全14。同样，人脂肪细胞易于采集，其重编程的效率是成纤维细胞的20倍左右15。人们也在探索鉴定iPSC的新方法。最近人们发现，通过分析细胞的某些表面标志，可以显示细胞的重编程程度16。
人多能干细胞的培养条件
最初，人们采用小鼠ESC的培养条件，稍加改良后即用于人ESC的培养17，18。这一方法需处理小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），使其丧失分裂活性，作为培养胚胎干细胞的饲养层，然后在体系中加入20%胎牛血清（FBS）。在此条件下，hESC细胞系可在无限传代的同时，仍保留其多能性1。利用含饲养层和动物血清培养hESC，限制了hESC临床应用的可能性，因为：（1）体系中含有免疫原性物质；（2）有传染动物病毒或朊病毒的危险；（3）培养体系化学组成不清楚，不易进行质量控制。因此，人们对培养体系的优化进行了大量研究，以去除体系中的未确定成分和动物蛋白。有些小组已经研发了新的hESC培养体系，不同程度上去除血清和MEF饲养层。例如，血清可以用Knock-Out血清替代品替代，该血清替代品已商业化，与血清相比，可减少批次间差异。但是，Knock-Out血清替代品的化学成分仍未完全确定19。Xu等采用BD公司的Matrigel作为培养的基质，加入以动物血清和bFGF培养的MEF条件培养液，以避免人ESC与基质层的直接接触20。也有人直接采用人饲养层替代小鼠MEF21。虽然体系中使用人细胞，避免了动物源微生物的传播，但饲养层所分泌因子的化学成分仍是未知，而批次间的差异很大，不利于实验的稳定性和可重复性。
真正的无饲养层体系，采用细胞外基质及TGF-β和bFGF，或单纯高浓度的bFGF，同时体系中加入含动物成分的血清替代品22，23。最近，很多研究小组也报告了其它hESC培养体系，均无异种成分或无饲养层24-28。mTeSR?1为无血清培养体系，由WiCell?研究所（Madison, WI）Ludwig领导的小组研发，适用于hESC和hiPSC在无饲养层情况下长期培养28。mTeSR?1含有bFGF、TGF-β、γ-氨基丁酸（GABA）、哌啶酸和氯化锂。最近的研究表明，mTeSR?1能支持人iPSC的诱导生成，并维持其体外增殖15，16。最近，Ludwig等又研制了适于构建和培养hESC的第二代产品，该产品完全无动物蛋白，体系中含有人血清白蛋白和由人源胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白组成的基质27。该产品已经商业化，商品名为TeSR?2。
hPSC的临床应用
由于hPSC的分化潜能，以hPSC为基础的细胞治疗，可适用于严重而不可逆的组织损伤或功能缺陷所造成的许多疾病。这种细胞治疗，有可能治愈心血管疾病、I型糖尿病、脊髓损伤和帕金森氏病。人们已经建立了诱导hESC分化的技术方法，使之分化为造血细胞29-31、心脏细胞32，33、神经细胞、视网膜色素上皮 34-36和成骨细胞等37。然而，hPSC为基础的细胞治疗临床应用，仍存在诸多障碍。目前，只有有限的实验证实hESC来源细胞具有分化细胞的全部功能。且所有功能实验均为动物实验研究，细胞治疗的有效性尚不能确定38。此外，hPSC分化具有高度无序性，定向分化为某一类细胞的效率偏低，细胞产量少。在诱导hPSC分化过程中，细胞很难定向分化，从而有非目的细胞污染的现象。更应注意的是，分化后细胞群体中有未分化hPSC的可能性，有导致畸胎瘤的风险39，40。
开展以hPSC为基础的细胞移植治疗，需考虑供者细胞表达不同的主要组织相容性抗原，从而导致免疫排斥41。此外，利用动物成分培养hPSC，有可能导致细胞表达外源抗原42。利用病人体细胞作为起始细胞构建iPSC，可以避免组织相容性问题2-4。尽管动物抗原的表达能否导致的细胞排斥，至今仍未有统一的结论43,44，科学家和商业团体仍致力于研制无异种蛋白成分的培养基和基质，进行hPSC的扩增和诱导分化。虽然有些诱导分化方法也适用于iPSC,但是，起始细胞类型往往影响重编程细胞定向分化为某一细胞群的能力45。利用iPSC分化的细胞进行临床治疗，有赖于对iPSC生物学特性和重编程机制的进一步认识，依赖于上述hPSC治疗难点的解决。
然而，以hESC为基础的细胞治疗，正在逐步接近临床应用阶段。例如，将ESC分化的寡突祖细胞，移植给脊髓损伤的大鼠，可明显改善髓鞘再生，促进运动能力的恢复46。为此，Geron打算启动人临床试验研究。此外， 先进细胞科技公司希望利用hESC分化的视网膜色素上皮，开展I期临床试验，以治疗黄斑退化。
hPSC在药物筛选和毒理测试中的应用
目前，药物研发或毒理实验是hPSC最有可能应用的领域。据估计，将一个新药推向市场，经过研发、临床试验和FDA批准等过程，需要耗资8亿至13亿美元47。尽管如此，最终能成药的数量极低。鉴于药物研发的高成本和药物公司承担的高风险，使用生物学相关的人细胞进行药物的早期测试和筛选，具有很大的优势。未分化的hPSC可以被用于鉴定某些化合物的致畸和毒性作用。在hPSC分化实验中加入筛选药物，可以明确待筛药物是否具有促分化功能。例如，某一化合物如能促进hPSC分化，产生大量的诸如神经和心肌细胞等终末细胞，就可直接采用相应的细胞，研发心血管或神经退行性变疾病的治疗药物。再如，某一化合物能促进肝细胞的产生，就可直接用于毒性检测。此外，从病人体内采集疾病相关的体细胞，构建疾病特异性的iPSC，不但可以用来探讨疾病的生物学基础，也可为研究疾病治疗的新措施，源源不断地供应相关细胞。
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