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网友[cox_1]：

最近做过些细胞活性的测定，用过MTT，也用过CCK-8：
MTT：步骤有点烦琐，中间有吸液的步骤会造成不可避免发生误差，特别是加DMOS前的一步，会吸走不少的结晶，后来改进了方法，用2%SDS-HCL溶结晶，不需要去培养基，但是必须37度过夜，耗时比较长。另外MTT反应，这一步，至少需要3小时，如果要做某个药物的急性作用，用这个方法就不太好了。
CCK-8：是MTT的改进，步骤简单，中间不需要吸出孔内的培养基，这样就减小了误差，另外CCK-8反应时间也短，最短1个小时就够了，特别适合做急性作用。缺点是有点贵。

我的疑问是：
1、不管是MTT还是CCK-8，原理基本是一样的，都是发生反应生成有色物，只不过一个是难溶于水的晶体，一个是直接溶于水的。我的问题是，如果做急性作用，是不是可以再缩短反应时间（当然OD值不能太小）？比如，缩短至半小时？另外，最后所测得OD值应该是MTT或CCK-8反应时间内细胞活性的综合反映吧？
2、平行孔的OD值，最科学的分析方法是怎样的？ 有的人把平行孔相差很大的值去掉，只保留比较接近的值，理由是：相差很大的值，很可能是操作带来的较大的误差，不可信。我个人觉得，这样做不科学，但是也找不到很好的解决办法。还希望各位给点意见。

网友[twoicedragon]：

首先感觉MTT最好现用现配，使用时避光，虽然有资料说可以长期4度存放，但觉得时间久了还是很容易出问题！另外就是最后一次加药或换液要用无血清的培养基，我的经验就是血清对结果的干扰还是很大的！还有就是做实验的复孔要尽可能的多！我的每次都要做几十个复孔才能保证实验结果！

总之自我感觉这个实验方法虽然很简单，但要出好的结果还是蛮难的！对照组一定要设置全！这个才能出了好点的结果！

网友[shuaih]：

我做过alamar blue ，MTT，台盼蓝，感觉上，台盼蓝可以分辨出死细胞，但是计数不如其他两种精确；MTT反应产物停留在细胞内，必须破坏细胞膜才能检测，可以用DMSO＋SDS＋HCL或醋酸 配置破膜溶液，效果一直很好，但是由于细胞死亡，无法进行后续检测，最多只能同时测培养基里面的物质如ALP等，所以要求很多样品数才能做完其他检测方法，还有一点就是，MTT的反应产物总是同时存在于细胞内和培养基中，这对实验结果有一定影响，造成MTT的可重复性不佳。alamar blue，则对样品数要求相对少，因为alamar blue 的产物resorufin是可溶的，可以检测培养基里面的resorufin而不必破坏细胞，但是由于resorufin是偏红色的，所以只能用无酚红培养基，对培养的时间要求也相对MTT来说要苛刻，还有一点就是alamar blue的花费也较高。

网友[dabao]：

我以前曾参与研究开发一种天然来源的免疫抑制剂。该物质被证明主要是由多肽类物质组成。我们以3H-TdR参入法测定免疫抑制剂对PHA诱导的人外周血淋巴细胞（PBL）转化的影响，组分活性以对PHA诱导的人PBL转化的抑制率表示。

具体步骤是：

将待测样品用RPMI-1640培养液稀释成一定浓度。以无菌手续采集3人份静脉血，每1ml加10u的肝素钠抗凝。取24孔培养板，向每孔内加人外周血0.1ml，对于每个人的血样做3个重复孔。向每孔内加入含10%小牛血清的RPMI-1640培养液1ml、PHA应用液0.1ml。试验孔加样品液0.1ml，对照孔加RPMI-1640培养液0.1ml，加盖后在CO₂培养箱中于5% CO2、37度条件下培养48h，加入浓度为3.7×10⁵Bq/ml （10uCi/ml）的3H-TdR 0.1ml，混匀后继续培养24h，用49#玻璃纤维膜收集淋巴细胞，用液体闪烁计数器计数每分钟的闪烁次数（cpm）。将每个人3个重复试验孔cpm的平均值作为试验样品作用于该人血样后的cpm值，按下式分别计算样品对PHA诱导的每个人PBL转化的抑制率：
抑制率（%）=（1－实验组cpm/对照组cpm）×100%
以3个人血样抑制率的平均值作为样品的活性。

该试验重现性很好，结果也较为可靠。
但是个人感受是“都快怕了”做这个试验了。首先是放射性，莫名；然后是细胞试验本身（细胞是人源原代，本人当然首当其冲是第一个志愿者；原代培养本身也有点），当然，这与该测定细胞活力方法本身无关；再次是时间较长；还有在自己单位不能独立完成，需要很多特殊设备。

网友[楚布衣]：

对细胞增殖实验来说，MTT、CCK-8和3H-TdR 我都做过。感觉是前者便宜、步骤烦琐、对实验技能要求大，否则误差较大、敏感度在三者中最低。CCK-8稍贵一点、步骤简单、稳定性不错、敏感度介于两者之间。3H-TdR 敏感性最好、但步骤较多、需要特殊设备，最大的问题是有放射线。 所以综合评价，我们觉得CCK-8简单、稳定、敏感性好、安全、价钱还能接受，所以现在细胞增殖实验主要用CCK-8来做，敏感性要求特别高的就用3H-TdR （没有小孩的、女性的一般还是避免用3H-TdR ），而MTT主要用来做学生实验。

网友[lillyjin]：

我的实验用过台盼蓝染色、MTT、CCK-8。我分离的是病人的淋巴细胞，经不同浓度的药物处理后，检测细胞增殖变化，台盼兰染色可以发现药物抑制细胞增殖是因为药物作用还是浓度大引起的毒性反应。可以发现较大的浓度药物经台盼兰染色后活细胞比例低。大部分文献对淋巴细胞增殖测定方法，用的是3H-TdR。我们实验室的这种仪器坏了，我查阅做淋巴细胞也有人用过MTT法，所以一开始我用MTT算是一个预实验，测定细胞增殖能力如下：培养的淋巴细胞浓度为1×10⁶/ml、200μl/孔加入平底96孔板，设三个复孔，再加浓度为5mg/ml的MTT，25μl/孔，CO₂下孵育4小时；1500r/min离心后轻轻吸出150μl/孔上清，再加入150μl/孔的二甲基亚砜，静置10分钟后在酶联检测仪上（570nm）测定吸光度（A，曾称光密度OD）；用每组三个复孔A值的平均值来比较，A值高，则增殖快。但是结果不理想，可能淋巴细胞为悬浮生长，MTT中间环节多，容易吸出细胞，结果不稳定．后来看过CCK－8的资料，就试着用用，跟MTT相比，步骤简单，省时省力，缺点当然是比MTT贵多了。每次的结果稍有不同，统计学还是有意义的，主要经验体会是：细胞量要够大。至少每孔保证105的量，其次要充分混匀，最好在摇床上摇荡几分钟．孵育时间要摸索，淋巴细胞在48小时的结果最好。

网友[ichi_only]：

XTT法
XTT{2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulphenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide}是MTT的一种衍生物，可被活细胞线粒体的脱氢酶还原产生水溶非细胞毒性的Formazan产物而显色，显色程度与活细胞数成正相关。主要优点是反应产物为水溶性，对贴壁和悬浮生长的细胞均适用，检测时间缩短和处理步骤减少，但本底较高，重复性受pH的影响，其它与MTT法相同。

此外还有MTS法
MTS[3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-etrazolium,inner salt]为新一代四氮唑蓝盐化合物，其被还原形成的Formazan产物水溶性和稳定性更高，显色更快。

网友[fird]：

其实直接计数法也是一种非常好的方法，至少比MTT来得准确。

首先在10cm的Dish中接种1000-10000个细胞，然后培养1周至2周，消化后，进行计数。此法简单易操作，也非常公认，主要是依靠时间来放大不同处理组的差异，原理与clone formation assay 差不多。

此外，BrdU掺入法也是不错的检测细胞增殖的好方法，原理3H放射性同位素掺入法一样，但可以不接触同位素，用荧光显微镜或FACS即可检测。

网友[mjpl04]：

H3掺入试验、MTT比色法、XTT比色法都属于测定淋巴细胞体外增殖反应的方法吧。我最近也要做关于这方面的实验，就把师兄介绍的测细胞增殖反应时应注意的问题说一下吧：
1、丝裂原的质量和活性是测定淋巴细胞增殖反应的关键因素。因此在实验前，应确定其最佳刺激量。
2、检测T细胞增殖反应，丝裂原用PHA或ConA；B细胞增殖反应用LPS或SPA；T、B细胞增殖反应用PWM。
3、增殖反应的细胞应保持高活性，一般应〉=95%。应用单抗分离制备的反应细胞因保存剂（如NaN3）或抗体的直接作用可抑制细胞的增殖。此外，增殖细胞的浓度过高或过低均不利于细胞生长。
4、细胞培养液应无菌、无支原体污染，特别是小牛血清加热灭活补体，避免LPS或其他能促进细胞增殖物的污染。因此，实验前应选择本底低的小牛血清。用人“AB”型血清或自体血清也应加热灭火补体。