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网友[along911811]：

做细胞毒性加药设计和操作一直觉得是个可大可小的问题 ，估计结果重复性差可能有这方面的原因，总结一点自己的惯用手法：
1、首先用培养基将细胞毒性药物（待测药物）5倍，系列稀释，共制备8个浓度。选择浓度时应以最高浓度下多数细胞被杀死，而最低浓度下不会杀死细胞为标准，只要对药物的毒性有所了解，便可采用较小的浓度范围。一般情况下，我每种药物使用三块培养板，这样一次试验中可以有三个平行测定结果。
2、对于贴壁生长的细胞，去除第2-11列个孔中的培养基，这样可以通过将注射器针连在吸引管上来完成。
3、在第2列和第11列共8个孔中，加入200ul新鲜配置的培养基，这些细胞作为对照。
4、在第3-10列的细胞中加入细胞毒性药物，每个药物浓度仅需4个孔，这样A-D 用于一种药物，E-H用于另一种药物。
5、将药物溶液向每组的4个孔中各加入200ul。
6、温育。

网友[kenthern333]：

MTT法测定样品的生物活性，我也曾经做过不少实验。
前期的细胞铺板，样品处理都是很常规的实验室操作。
染色阶段：我们一般是 将MTT用细胞培养液（1640或DMEM）稀释成5%的溶液，过滤除菌，于96孔板中加入10-20ul/孔，再于孵箱中放置4-6hr。
溶解： 可以使用10%SDS或者DMSO。
10%SDS可以直接加入96孔板50-100ul/孔（依据不同实验来确定），再在孵箱中放置过夜，并于酶标仪上在一定波长（570nm左右）下读数。 该96孔板在随后的2-3天内的读数不会有太大的变化。
使用DMSO时，一般需要将96孔板中的上清夜除去，然后加入100-200ul/孔的DMSO。静置20-30mins，于酶标仪上在一定波长（570nm左右）下读数。
DMSO的优点是：仅仅需要30分钟就可以读取数据，实验时间大大缩短。
DMSO的缺点是： 加入DMSO时，先要除去96孔板内的上清夜， 可能会造成细胞的损失，给实验结果带来不必要的误差。

网友[myowneye6788]：

酸性磷酸酶（Acid phosphotase assay）
原理是这样的：
将一种底物（硝基苯磷酸盐）与细胞一起孵育（就是加到96孔板的孔里），细胞溶酶体里面的酸性磷酸酶将底物水解生成另外一种可以显色的物质，用酶标仪在405nm处测量就可以。显色程度反映了细胞里酸性磷酸酶的活性，进而反映了细胞的活力。
这个方法大约十年前外国人发现的，同H3掺入以及MTT也作了比较，提示完全可以代替。而且非常干净。而且很便宜，只需要买底物就可以（5g大约400元 Fluka）。

网友[MichaelHLee]：

我用的是WST－1法。理论上，WST－1法显色原理与MTT法相似，但是WST－1是水溶性的，MTT是脂溶性的，因此WST－1法比MTT法处理过程要简便，受影响因素少，只需将种好板的细胞的培养基从孔板中弃去，然后加上200微升PBS和20微升WST－1溶液（自己配制的，用PMS和WST－1按一定比例加PBS涡旋混合后，在－4摄氏度保存，避光。），同时加上空白对照。置二氧化碳孵箱中约3小时后，直接在酶标仪下测定OD值，450nm/650（690）nm，然后将值减去空白对照后，对比差值即可。

网友[luopeng]：

MTT法作了很多细胞，感觉对于贴壁细胞效果好，对于悬浮细胞，因要吸弃培养液，很容易造成formazan流失，因而导致实验结果偏差。SRB是一种活性蛋白染料，能与细胞蛋白的碱性氨基酸结合而显色，在490nm~520nm波长处其OD值与活细胞数成良好的直线关系。SRB法已被NCI选定作为筛选抗癌药物的新方法，相对于结晶紫法或目前普遍采用的MTT法，其灵敏度好于结晶紫法，相当或优于MTT法。

除此之外SRB法还有以下优点：　
1、操作时间短，细胞固定和染色仅需90分钟左右，而MTT加样后还需培养4小时。
2、没有严格时间限制，在TCA固定后或SRB结合后的细胞均可存放，Monks指出样品保存7天，测定的OD值下降不超过2％。
3、可以测定悬浮细胞，采用16% 的三氯乙酸直接加入培养细胞中能完整酸化固定细胞，较之MTT法或结晶紫法离心取上清的操作，不会带来细胞损失，测定结果更准确。因此选用SRB法对于测定不易贴壁的PC12细胞存活率，结果更灵敏准确，重复性更好。

建议大家可以试一下SRB法，SRB价格也便宜。

网友[moldir]：

我最近也在做MTT，确实很不稳定，组间差异就很大。前面大家已经说了很多了，我觉得还应注意的是：
1、培养基中酚红、人血清蛋白、免疫球蛋白、小牛血清、胎牛血清或马血清和某些添加剂可使OD值增高，影响结果。因此这类物质在进行MTT时应先洗去。
2、加入DMSO后应及时检测，OD值受作用时间的影响较大，颜色会随时间变深。
3、接种细胞数要合适。在应用一种新细胞株时，首先要知道该细胞株的细胞倍增时间，而在应用非分裂的原代细胞（如神经元或肝细胞培养）时，首先要知道该细胞在培养过程中细胞丢失的数量。根据这些信息选择合适的接种细胞数量。在MTT法进行时，96孔板中每孔的细胞数量宜控制在5×10²～5×10⁴范围。
4、每孔内各区的细胞生长不均匀可直接影响实验结果。当加药液或换营养液时，药液或营养液沿孔边缓慢加入，但不能直接加在细胞上。细胞培养的每一步操作时尽量避免产生细胞生长不均匀的各种因素。

网友[zoumiejie]：

前面有位前辈提到PI染色检测细胞活性，我也是做细胞培养测药物作用后细胞活性的，前一段时间在网上查到一点PI方面的资料，希望有帮助。
流式细胞仪检测细胞凋亡——Heochst 33342/PI双染色法
来源：生命经纬

基本原理
经固定的凋亡细胞其染色体荧光染料的DNA可染性性下降。细胞一经固定就不再是活细胞，而且细胞固定过程对细胞膜的通透性也有影响。因此发展了用“细胞活性”鉴定染料染色的流式细胞仪检测方法。这些方法细胞不经固定就直接用DNA染料染色，且染料的浓度要比固定细胞所用的浓度要低得多。流式细胞仪通常根据细胞膜完整性将细胞分为“活细胞”和“死细胞”，因此正常细胞和凋亡细胞归为活细胞。活细胞染料如Hoechst 33342能少许进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高，Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度增高的机制与凋亡细胞膜通透性发生改变有关，凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有明显性改变，但细胞膜的通透性已有增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多。此外，还与凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合以及凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等有关。既然Hoechst 33342进入凋亡细胞中比正常细胞更容易，而EB、PI或7-AAD等染料是不能进入细胞膜完整的活细胞中，即正常细胞和凋亡细胞在不经固定的情况下对这些染料是拒染，坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被这些染料染色。根据这些特性，用Hoechst 33342结合PI或EB等染料对凋亡细胞进行双染色，就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现分别为：正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst 33342++/PI+），坏死细胞为低蓝色/高红色（Hoechst 33342+/PI++）。

试剂与仪器
 Heochst 33342 染液：用PBS配成10ug/ml的储存液浓度，4℃避光保存；
 PI染液 ：用PBS配成5ug/ml浓度，4℃避光保存。
 400目的筛网
 流式细胞仪

实验步骤
1、悬浮生长的细胞在培养的状态下加入Heochst 33342 ，终浓度为1ug/ml； 37℃孵育7—10min。
2、低温500 ～1000r/min离心5min弃去染液。
3、加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。
4、400目的筛网过滤1次。
5、流式细胞仪分析：Heochst 33342用氪激光激发的紫外线荧光，激发光波波长为352nm，发射光波波长为400 ～500nm，产生兰色荧光；PI用氩离子激光激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光。分析兰色荧光对红色荧光的散点图或地形图。
6、结果判断：在兰色荧光对红色荧光的散点图上，结果为：正常细胞为低蓝光/低红光，凋亡细胞为高蓝光/低红光，坏死细胞为低蓝光/高红光。

注意事项
1、在红色荧光对兰色荧光散点图上，还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹，可能是凋亡细胞的DNA进一步降解的缘故。
2、用Heochst 33342染料与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在20min之内为宜。如果太长可引起Heochst 33342的发射光谱由蓝光向红光的迁移，导致红色荧光与兰色荧光的比例改变，从而影响结果的判断。