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RNAi早期研究

    RNAi（RNA interference）是一古老的机制，最初来源于1990年Napoli在牵牛花Napoli et al. Plant Cell, 1990和Cogoni在脉孢菌Cogoni C and Macino G. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997中的发现，即转基因的共抑制现象。早期认为基因共抑制是基因副突变的范畴，但是靶基因序列具有明显不同的特征，前者是遗传下来不表达的序列，是在等位基因作用下基因发生的表遗传沉默；后者在引入抑制基因前却是可以表达的序列。此外，基因共抑制是发生在转录水平还是转录后水平在一段时间内引起了争论：van der krol认为共抑制是外源基因引入细胞后，目标基因过渡转录，从而产生负反馈van der Krol AR, et al. Plant Cell. 1990.；Grierson认为共抑制是不相关的基因启动子被激活，转录出可以与目标基因互补的反义RNA (Grierson D, et al. Trends Biotech,1991)；Jorgensen则认为基因共抑制是外源基因与细胞内的同源内源基因发生异常配对，干扰了染色体的稳定性，从而导致转录受到抑制Jorgensen R, et al. Trends Biotech. 1990。后来人们在拟南芥中进一步观察到，共抑制是发生在转录后水平，而不是转录水平，称为转录后基因沉默（PTGS）。

RNAi理论形成

    针对RNA沉默现象的决定性发现还是由Andrew Fire和Craig Mello首先完成的。早在几年前，在线虫中进行反义RNA实验时，美国Cornell大学的Guo和Kemphues就观察到正义RNA也具有很高的基因沉默活性Guo S and Kemphues KJ. Cell, 1995。后来华盛顿Carnegie 研究院的Andrew Fire和Craig Mello通过实验阐明了这一反常现象：将反义RNA和正义RNA同时注射到秀丽隐杆线虫比单独注射反义RNA诱导基因沉默的效率高10倍。后来他们得知制备正义RNA或反义RNA时都污染了痕量的双链RNA，Guo和Kemphues以前的发现以及后来Andrew Fire和Craig Mello所观察到的现象并非来源于正义RNA或反义RNA。由此推断，dsRNA触发了高效的基因沉默机制并极大降低了靶mRNA水平Fire A and Mello CC. Nature, 1998，人们将这一现象命名为RNAi。8年以后，2006年的Nobel医学和生理学奖授予了Andrew Fire和Craig Mello。

发现哺乳动物存在RNAi机制

    在RNAi发现后的几年间，人们对线虫、拟南芥、脉孢菌、果蝇的进一步研究揭示了RNAi的作用机制，发现了参与RNAi过程中的几个重要的分子和元件：起干扰作用的siRNA；切割dsRNA产生siRNA的Dicer；起放大作用的RNA依赖的RNA多聚酶（RdRp），而且对RNAi调控基因表达也进行了研究。

RNAi的作用机制：

 RNAi的作用机制：

    然而，在很长一段时间内，多数人认为RNAi是低等动物特有的现象，如线虫，果蝇等，而不存在于高等动物，高等动物因为有进化后完整和强大的免疫系统足以取代在低等动物体内保留的RNAi机制，从而防御外来病毒等微生物的侵袭。人们在哺乳动物细胞中导入dsRNA以期待可以被加工后产生siRNA。可是dsRNA过长会产生干扰素样反应，这种反应在某种程度上与dsRNA反应性的蛋白激酶R（一种参与哺乳动物抗病毒反应的酶）激活有关。PKR磷酸化和翻译因子EIF2α失活会完全抑制了蛋白质的合成，并且启动随后的程序性细胞死亡。此外，干扰素可活化2′-5′-寡腺苷酸合成酶和核糖核酸酶L，最终导致mRNA的非特异性降解。

    其实，最早认为哺乳动物也存在RNAi机制的是MIT肿瘤研究中心的Sharp，他从事RNA分子研究多年，曾经因为提出mRNA的剪接理论获得1993年的Nobel奖（当时他的国籍是UK）。直觉和经验告诉他，RNAi同样存在高等动物体内。然而，由于当时多数人认为RNAi是低等动物特有的机制，因此没有人愿意承担这类课题，后来他的学生Tuschl为了完成Sharp教授的心愿，在MIT的Sharp教授实验室做了一些预实验，结果与Sharp预料的一样：哺乳动物也存在RNAi机制。不久，Tuschl从USA的Sharp实验室回到德国的Max-Planck研究所继续研究哺乳动物RNAi的机制，取得了重大发现，并于2001年5月在Nature上发表了第一篇哺乳动物RNAi的论文Elbashir SM and Tuschl T. Nature, 2001.

设计siRNA－Tuschl法则

    Tuschl是如何进行RNAi实验的呢？他又是如何克服干扰素反应和凋亡反应的呢？在Nature发表的论文中，他提到：长度为21-25 nt的siRNA瞬时转染体外培养的哺乳动物细胞能诱导RNAi，但并不启动细胞的程序性死亡而且不导致干扰素样反应。Tuschl和他的同事进一步研究发现，短于21 nt或长于25 nt的dsRNA（包括平末端的siRNA）均不能有效启动RNAiElbashir SM, and Tuschl. EMBO J, 2001.。只有3′ 末端带有2 nt突出核苷酸，5′ 末端的第一个核苷酸被磷酸化的短dsRNA（类似于Dicer的天然活化产物）才能有效启动RNAi。而这些特点是Dicer III型RNA酶的典型特征：将dsRNA切割成21-25 bp的RNA片断，即所谓的小分子干扰RNA双链体（small interfering RNA duplexes，siRNA）。根据这些特征，Tuschl认为，长度为21 nt的siRNA作用最强，通过脂质体转染合成的siRNA可以获得瞬时的干扰效应，而且是通过切割目的mRNA实现的。从此，不仅高等动物体内不存在RNAi机制的结论被打破，而且Tuschl设计siRNA的方法成为经典的siRNA设计方法，也为后来“新的Tuschl法则”制定奠定了基础。

RNAi靶序列设计