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RNAi研究的范畴

自从Tuschl发现哺乳动物存在RNAi机制后，RNAi方面的研究热潮一浪高过一浪。基本上，RNAi的研究主要集中在几个方面：一是继续利用低等动物来研究参与RNAi过程中的主要蛋白质和酶；二是研究RNAi如何调控基因的表达；三是利用RNAi技术进行基因鉴定和发育和基因组研究；四是利用RNAi来治疗疾病。

用RNAi治疗疾病

其中，MIT的Novina最早利用RNAi来抗HIV，开启了利用RNAi治疗病毒性疾病的先河。Novina与哈佛大学血液研究所的Shankar教授合作，试图利用RNAi来治疗AIDS。他们的研究成果发表在2002年7月的Nature Medicine上Novina CD et al. Nat Med, 2002.，并被Science评为“年度突破”。不久哈佛的宋尔卫博士和Shankar继续RNA干扰HIV方面的研究，取得了不错的成绩Song E and Shankar. J Virol, 2003；Song E and Shankar. Nat Biotechnol. 2005，并利用RNAi进行体内抗HBV研究Song E, et al. Nat Med, 2003.。除利用RNAi来进行抗病毒治疗外，人们期望利用RNAi来治疗恶性肿瘤、神经元退变和眼科疾病。然而，利用siRNA治疗疾病需要解决几个问题：（1）导入问题，使用高效载体传递siRNA；（2）和给药方式，因为RNA容易被降解，如何提高siRNA在体内的稳定性；（3）高选择性。如何靶向特定细胞而不影响其他细胞。

FDA批准进行临床试验的RNAi药物

现在，第一个RNAi药物Bevasiranib（Acuity Pharmaceuticals公司）已经诞生。2004年FDA批准Bevasiranib进行临床试验。2006年9月12日，公司公布Bevasiranib sodium（Cand5）的II期临床试验结果：Bevasiranib对湿性老年性黄斑变性（AMD）的治疗效果。对129名患者的试验发现，Bevasiranib能够减缓患者眼睛中血管的生长并改善视力：在最低剂量时，这种效果持续了数月；最高剂量时，这种好的效果一直到研究结束还存在。而且，试验中，除了药物注射位置的红肿外，没有观察到其他任何不良反应。目前，FDA已经批准Bevasiranib进入III期临床实验。除Acuity Pharmaceuticals公司外，另有两家公司也在进行RNAi药物的开发，一是Alnylam Pharmaceuticals，其股东正是1993年Nobel医学和生理学奖的获得者Phillip Sharp，他们开发的RNAi药物用来治疗呼吸道合胞病毒、流行性感冒、帕金森病和高胆固醇血症等；二是Sirna Therapeutics，此公司原来叫Ribozyme，后来乘机改名为Sirna，目前他们开发治疗ADM的RNAi药物Sirna-027已经进入I期临床，其他方面的应用如治疗Huntington病和哮喘以及COPD也进入临床前研究阶段。

在哺乳动细胞内进行RNAi

目前，人们更多是利用siRNA来沉默基因的表达，从而研究基因的功能。尤其在国内，利用RNAi来沉默哺乳动物特定基因的研究越来越多。与传统的翻译寡核苷酸相比，同等量的siRNA可以强数10倍，在体内更稳定，半衰期长达24小时，将siRNA导入细胞内，一般可以使基因表达的抑制率达到90%。然而，如何在哺乳动物进行有效的RNAi实验呢？基本步骤是：

1）检索特定基因的序列，避免靶向部位是非编码区和基因间隔区；

2）设计siRNA序列，可在mRNA中随机选取多个19-21 bp的序列，不考虑位置；或者参考“Tuschl法则”进行设计，并进行BLAST；或者利用芯片筛选siRNA。现在多家公司提供了siRNA设计工具，如Invitrogen，Qiagen，Dharmacon，Cenix Bioscience和Ambion公司。具体设计原则见Rules of siRNA design for RNA interference (RNAi)

3）获得用于RNAi研究的siRNA，主要方法有：

化学合成，目前用于化学合成的仪器主要来自ABI公司和Amersham生物公司的合成仪；

T7启动的体外转录合成，例如T7 RiboMax RNAi，T7 RiboMax EXpress RNAi系统和Silence siRNA Construction

使用重组的Dicer或其它的RNase Ⅲ家族的酶、核酶消化长片断dsRNA；

使用质粒表达siRNA；

使用病毒载体（腺病毒，腺相关病毒，慢病毒）内源性表达siRNA和lhRNA；

使用PCR来源的siRNA表达框内源性表达siRNA；

构象调节核酶内源性表达siRNA；

应用商业化的siRNA/shRNA/lhRNA文库。

参考书目：

1. Ute Schepers主编, 王俊, 宋尔卫主译. 实用RNAi技术－－线虫、果蝇和哺乳动物细胞基因沉默的基本原则与方法. 2006. 人民卫生出版社.
2. Gregory J. Hannon主编. 陈忠斌主译. RNAi――基因沉默指南. 2004. 化学工业出版社.
3. 宋尔卫主编. RNA干扰的生物学原理与应用. 2005. 高等教育出版社

目前，国内RNAi研究处于白热化阶段，多数实验室已经开展或即将开展RNAi方面的研究。在PubMed、VIP和CNKI上检索，可以发现RNAi的研究热潮一年盛过一年，而且，microRNA的研究虽然较晚，但也步步逼上：

以不同关键词检索VIP数据库RNAi方面文章（2000-2006上半年）：

以不同关键词检索CNKI数据库RNAi方面文章（2000-2006上半年）：

以不同关键词检索PubMed RNAi方面文章（2000-2006上半年）：

以不同关键词检索Cell杂志RNAi方面文章（2000-2006上半年）：

   
编辑：西门吹血