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核酸抽提:七零八碎的实验数据和推理

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发布日期:2009-04-21 14:04 文章来源:丁香园
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关键词: 核酸抽提 实验数据 推理   点击次数:

1. 苯酚保存条件的实验

苯酚的保存条件,正统的说法:避光、4C、上覆一层液体、密闭,可保存1个月。

下面是我的一个实验:

3月10日,取Tris饱和苯酚(加入beta-Mercaptoethanol抗氧化)到6个透明1.5ml离心管中,其中3管再覆盖少量液体。取一管未加液体的和一管加液体的放入4C冰箱,其余4管置于室温。室温的4管有两管(加液和不加液各一管)用刀子将离心管盖子钻了一个洞,使之与空气接触。没10天观察一次颜色变化,直到7月20日(130天)。

现象:直到6月20日,所有的苯酚都没有发生颜色的变化;尽管此时钻洞的离心管上清已经没有了,苯酚液减少了。到7月时,室温钻孔的颜色开始有一点变化了,其它的几乎无。

结论:苯酚的稳定性最相关的是空气,温度、光线都只是氧化反应的加速因素。

应用:确保苯酚稳定的关键,是将苯酚分装成小包装。包装大小控制在1个月用完的程度。500ml苯酚可以分装到100ml瓶子中,用Parafilm封住暂时不用的。用完一瓶再开另外一瓶。如果有塑料瓶,-20C保存则更好;玻璃瓶千万不可-20C保存,否则比破。

(本实验的前提是,苯酚本身质量是合格的)

2. EDTA的OD值

EDTA在核酸,尤其是DNA的溶解中广泛使用,Ambian也提到EDTA可以提升A260/280值。后者不是我关心的,我关心的是为什么EDTA会对OD值有影响以及如何影响。

实验:以水为空白,测定EDTA的OD值

EDTA浓度(uM):12/120/335/500

A230:0.006/0.073/0.207/0.313

A260:0/0/0.005/0.007

A280:0/0/0/0

结论:以水为对照,5mMTris以及低于此浓度时,A230-A280读数几乎是0,所以,谈论TE溶解就可以简化为E溶解。TE溶解的DNA,EDTA一般为1mM,10倍稀释则为100uM。此时,如果以Tris作为对照,你就没有必要去测定A260/A230了,因为A230由EDTA的贡献可不小。如果你溶解核酸的溶液含EDTA,一定要使用该溶解液作为测定空白和稀释的溶液,否则,NBA明星的广告词非常适合:youwerefooled.

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编辑: ludongcn 作者:上海孤儿

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